銅グリッドをテストチューブに戻すと、cLTMが明らかになります

以前のすべての出版物ショウジョウバエの嫌悪的な嗅覚条件付けを含むことは、同じ設計原理から派生した行動分析装置と手順を使用しました10。つまり、ハエは、電気ショックを与える銅グリッド表面を備えたトレーニングチューブでトレーニングされ（図1a、左パネル）、銅グリッドのないテストチューブでテストされます（図1a、中央パネル）。したがって、これまでの研究では、銅グリッドの存在を必要とする嫌悪的な記憶要素の検索はありませんでした。銅グリッドが試験管に戻されたとき（図1a、右パネル）-匂いの鋭敏さに影響を与えない手順（補足表1）または誤った記憶能力をもたらさない手順（補足図1a）、行動アッセイは明らかにしました印象的な効果。単一試行の条件付けは、間隔を空けて繰り返される試行でも、以前に見られたものよりも長く持続する銅グリッド依存の記憶コンポーネントを生成しました。具体的には、記憶は少なくとも14日間続き、これはテストされた最長の期間でした（図1b）。

この銅グリッドに依存するメモリの強化がコンテキスト回復の一般的な効果を反映しているかどうかを判断するために、トレーニング環境の他の要素、特に周囲の光の色とハエとしての環境温度を変更しようとしました両方に応答することができます32,33。テストで赤色のトレーニングライトが黄色に切り替えられた場合、またはその逆の場合、銅グリッドが提供されていても、メモリの拡張は発生しませんでした（図1cおよび補足図1c）。同様に、テスト温度が学習温度と著しく異なる場合（23°C対32°C、またはその逆、図1cおよび補足図1d）、増強は消失しました。したがって、エンコーディングコンテキストの環境条件を変更すると、銅線グリッドに依存するメモリが完全にブロックされました。

ただし、エンコーディング環境とテスト環境の違いは、取得に影響を与えるために十分に重要であるか、簡単に検出できる必要がありました。銅グリッドに依存するメモリ。たとえば、テスト温度をエンコード温度23°Cからテスト温度25°Cに変更しても、メモリの強化は維持されました（補足図1e）。

いずれの場合も、銅線の取得グリッドに依存するメモリには、条件付けされた匂いとエンコーディング環境コンテキストの完全な回復が必要です。これが、このメモリコンポーネントをコンテキスト依存LTM（cLTM）と呼んだ理由です。

cLTMはタンパク質合成依存の統合を必要としません

ほとんどの研究では、間隔を空けたトレーニングプロトコルを使用してLTMを誘発しただけです。 、およびLTMはタンパク質合成に依存するため3、cLTMにタンパク質合成に依存する統合が必要かどうかをさらに判断しました。注目すべきことに、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（CXM）の投与はcLTM形成に影響を与えなかったため（図1d）、同じ治療がLTM形成をブロックしたため（補足図1d）、このような長期記憶の形成はタンパク質合成とは無関係でした。 。1f）、予想通り3,8,9。この観察を裏付けるように、トランスジェニックハエ（UAS-RICIN; nSyb-Gal4）における、真核生物のリボソームを不活性化するタンパク質であるRICIN34の汎ニューロン発現によるタンパク質合成の阻害は、cLTM形成にも影響を与えませんでした（補足図1g）。トランスジェニックハエのLTM5をブロックすると報告されているcAMP応答エレメント結合タンパク質2（CREB2b）のリプレッサーアイソフォームの汎ニューロン発現（UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4）を通じて、このような独立性がcLTMに影響を与えないことをさらに確認しました（図1g）。さらに、古典的な学習および記憶のルタバガ（rut）変異体、rut1およびrut2080は、cAMP合成が弱められており、通常のcLTMを実行しました（図1h）。したがって、提示されたデータは、cLTM形成がタンパク質合成を必要とせず、したがってコンテキストに依存しないLTMとは異なることを強く示唆しています。 cLTMは、ARMが損なわれている間、大根変異体（補足図1h）では正常なままであるため、麻酔抵抗性記憶（ARM）とも区別できます35。

これらの驚くべき発見を検証するために、 cLTMには時間がかかります。これは、統合のもう1つの指標です。この目的のために、我々は、短期および中期の記憶を廃止することが知られているコールドショック治療に対するcLTMの耐性を特徴づけました3,8。トレーニングの24時間後、cLTMは通常のコールドショック治療の影響を受けませんでした（図1d）。このような耐寒性により、2つの追跡実験を行うことができました。

最初に、1回の条件付け試行の直後に2分間の耐寒性処理を適用しました。コールドショックから3分間休憩した後、行動アッセイにより、コールドショック耐性cLTMがすでに完全な強度で形成されていることが示されました（パフォーマンスインデックスの約20％;図1e）。次に、観察結果をさらに検証するために、トレーニング電気ショックの強度を60Vから20Vに下げて、メモリ強度の上限の影響を回避しました。このような弱いトレーニング強度でも、同様の強化がすぐにメモリに存在するため、cLTMがすぐに形成されることがわかりました。これは、cLTMの形成が減衰することなく長期間持続したことを示しています（図1f）。したがって、cLTMはトレーニング後3分以内に形成され、その形成にタンパク質合成の強化は必要ないことを示唆しています。

この驚くべき観察により、cLTMが従来のLTMと異なるのか、単に同じであるのかを調査するようになりました。さまざまな環境コンテキストで取得されたメモリ。以下に示す複数の証拠は、cLTMが異なる分子的および解剖学的特徴を備えた別個の記憶成分であることを示唆しています。

ドーパミン作動性ニューロンはcLTM形成に関与しています

LTM形成にはドーパミン作動性ニューロンが必要です（ DANs）、そこで、cLTMエンコーディングにおけるDANの役割を調べ、コントロールハエの24時間記憶を、トレーニング中にDANからのシナプス出力がブロックされたハエの記憶と比較しました。この目的のために、UAS-Shibirets1（Shits）の発現はTH-Gal4を介してDANを対象としたため、通常のシナプス出力は許容温度（23°C）では許可されましたが、制限温度（32°C）ではブロックされました36。トレーニングとテストの間で一貫した環境条件を確保するために、温度処理には厳格なレジメンを採用しました。具体的には、訓練中のシナプス伝達を遮断するために、ハエは訓練の30分前に32°Cの環境に移され、訓練の直前に23°Cに戻されました。その後、5分以内にトレーニングを完了し、24時間後に23°Cでテストしました。与えられた時間枠（5分）内で、たわごとを発現するニューロンのシナプス伝達はブロックされたままでした（補足図2a）。同様に、テスト中にニューロンの遮断が必要なアッセイの場合、ハエはテスト前に32°Cの環境に移動されましたが、23°Cでトレーニングおよびテストされました（図2a）。結果は、TH-Gal4標識ニューロンからの神経伝達物質の放出をブロックするとcLTM形成が損なわれることを示し、DANがcLTMエンコーディングに必要であることを示唆しています。この結論は、ショウジョウバエD1ドーパミン受容体（dDA1）-変異ハエ（dDA1dumb2）37またはdDA1の汎ニューロンノックダウンを伴うハエ（UAS-dDA1-RNAi; nSyb）ではcLTMが発生しなかったことを示した行動アッセイによってさらに裏付けられました。 -Gal4）（図2b）。これは、dDA1を介した神経調節がcLTMの獲得に役割を果たすことを示唆しています。

ただし、MBニューロンで発現したdDA1はcLTM取得に関与しませんでした。これは、dDA1dumb2変異体バックグラウンド（dDA1dumb2; OK107-Gal4）でのMBニューロンでのdDA1の標的過剰発現がcLTM取得を救済できなかったためです。これと一致して、MBニューロン（OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi）のdDA1ノックダウンはcLTMに影響を与えませんでした。これらのデータは、cLTMがdDA1を介した神経調節によってコード化されているが、MBにはコード化されていないことを示唆しています。

cLTMの取得はキノコ体ニューロンとは無関係です

興味深いことに、MBニューロンのdDA1はcLTMの取得には関与していませんが、この分野のこれまでのすべての研究では、従来のLTMを含む、コンテキストに依存しない嫌悪的なメモリコンポーネントの形成には、MBニューロンが関与していることがわかっています38,39,40,41。この観察を確認するために、cLTM検索におけるMBニューロンの役割を調べました。この目的のために、UAS-Shitsの発現は、2つの独立したGal4ドライバーであるOK107-Gal4とC772-Gal4を介してMBニューロンを標的としました（補足図2b、c）。 OK107-Gal4; UAS-Shitsハエ（図2d）ではLTMの取得に失敗しましたが、OK107-Gal4; UAS-ShitsおよびC772-Gal4; UAS-Shitsハエ（図2c、d）ではcLTMは無傷のままでした。 MBニューロンはcLTMの形成や検索には関与しません。

cLTMの取得にはALニューロンと投影ニューロンが必要です

cLTMの取得に必要な脳領域を特定するために、 ALローカルニューロンとプロジェクションニューロン（PN）。ハエの嗅覚情報は、感覚ニューロンからALニューロンとPNに中継され、次にMBとLH42に分岐します。最初に、OK66-Gal4でラベル付けされたALローカルニューロンからのシナプス出力をブロックする効果をテストしました（補足図3a）。制限温度でのシナプス伝達の遮断は、OK66-Gal4のcLTMを廃止しました。 UAS-たわごとが飛ぶ（図3a）。次に、投射ニューロンの2つの異なるサブグループの効果をテストしました。興奮性投射ニューロン（ePN）はMBとLHの両方に投射し、GH146-Gal4（補足図3b）でラベル付けされ、抑制性投射ニューロン（iPN）はMZ699-Gal4でラベル付けされたLH領域（補足図3c）。 ePNまたはiPNのいずれかの出力がブロックされた場合、グリッドが存在する場合の24時間のメモリ拡張は明らかではありませんでした（図3b、c）。これらの観察結果は、ALニューロンとPNが、以前に識別されたすべてのコンテキストに依存しないメモリコンポーネントと同様に、cLTM検索中に嗅覚情報の伝達に関与することを示しています。対照的に、LHに投射するMZ699-Gal4でラベル付けされたiPNは、嗅覚の慣れに必要ですが、文脈に依存しない記憶の検索には必要ありません28,43。 MZ699-Gal4のこの効果は、LHがcLTM検索で役割を果たすことを意味します。

cLTMの取得にはLHニューロンとAMMCニューロンが必要です

興味深いことに、LHニューロンは複数の遠隔脳領域に接続されています25。最近の発見は、LHがさまざまな感覚系の脳領域から多感覚入力を受け取ることを報告しています44。これらには、機械感覚情報を伝達する触角機械感覚および運動中枢（AMMC）、色覚33を担当する腹側外側前大脳（vlpr）、および味覚と温度に関与する他の領域32,45が含まれます。したがって、このような収束ニューロン接続は、複数の感覚モダリティを使用してcLTM検索を仲介すると仮定しました。

この仮説をテストするために、最初にAMMCにリンクされたLHニューロンのサブグループに焦点を当てました。このセンターは、ジョンソンの臓器から、触覚、聴覚、固有受容感覚、風感知など、さまざまな機械感覚信号を受信します46,47,48,49。次に、これらの信号をLH25を含む他の脳領域に中継します。 NP1004-Gal4の発現パターンは、NP1004-Gal4の膜標的マーカーmCD8：GFPの染色によって視覚化されました。 UAS-mCD8：GFPハエ（図4a、左パネル）。実際、NP1004-Gal4と免疫染色で標識されたAMMC-LHニューロンは、シナプス前マーカーsyt :: GFP（eGFPとシナプス小胞タンパク質シナプトタグミンの融合）がNP1004-Gal4のLH内で濃縮されていることを示しました。 UAS-syt :: GFPが飛ぶ（図4a、右パネル）。これは、AMMCからLHへのシナプス接続があることを示唆しています。

熱ショックによって誘発されるシナプス伝達の可逆的遮断は、NP1004-Gal4のcLTM検索を損ないました。 UAS-ハエをたわごと（図4b）。この観察を裏付けるように、R38E07-Gal4およびNP0761-Gal4で標識されたAMMCニューロンにおけるシナプス伝達の遮断もcLTM検索を抑制しました（図4cおよび補足図4c）。これらの結果は、AMMC-LHニューロン内の機械感覚情報の表現がcLTM検索にとって重要であることを示唆しています。この結論をさらに確認するために、トレーニング後にショウジョウバエの主要な機械感覚器官であるアリスタを除去することにより、機械感覚入力をブロックしました。結果は、この治療がcLTMを損なうことを示しましたが（図4d）、学習には影響を与えませんでした（補足図4d）。これは、cLTMにおけるAMMC-LHニューロンの役割を示唆しています。

次に、カルシウム応答を画像化しました。機械感覚刺激が小さなブラシでアリスタに適用された後のAMMC-LHニューロンのLH末端（方法のセクションを参照）。この目的のために、NP1004-Gal4によって駆動されるカルシウム感受性蛍光タンパク質50であるGCamP6fを発現させました。次に、LH領域からのGCamP6fの蛍光を記録しました（図4e）。 LH領域のブラシとのアリスタ接触に対して強い反応があり、機械感覚情報がAMMC-LHニューロンを介してLHに中継されるという概念を支持しました。

これらの観察が行動的に有意であることを確認するために、監視しましたハエの細胞内カルシウムレベルに比例してGFP発現を増加させる細胞内カルシウムの転写レポーター（TRIC）51を使用したAMMCニューロン活動。 AMMC領域からのTRICの蛍光は、検索の3時間後に計算され、コントロールのハエに対して正規化されました（図4f）。対照ハエよりも文脈依存性検索後または文脈非依存性検索後のAMMCで有意に大きなTRIC信号が観察され、AMMCニューロン活動が文脈依存性検索とよく相関していることを示しています。したがって、LHニューロンはAMMCからの機械感覚情報とALからの嗅覚情報を統合してcLTMを取得することができます（図4g）。

LHの多感覚統合はcLTM検索の根底にあります

次に、視覚系など、他の感覚システムもこのプロセスに関与しているかどうかをさらに検証しました。 cLTM検索中の眼（UAS-Shits; GMR-Gal4）および視葉ニューロン（UAS-Shits; R82D10-Gal4）の温度感受性変異体Shitsの標的発現を通じて視覚入力をブロックしました（補足図6a）。どちらの場合もcLTMは廃止され、視覚系もcLTM検索に関与していることが示唆されました。

このような視覚入力やその他の潜在的な感覚入力は、機械感覚の場合と同様に、おそらくLHニューロンに収束します。入力。利用可能なGal4系統でシナプス前マーカーsyt :: GFPの標的発現を行い、次のLHニューロン、LHより上内側前大脳（smpr-LH; MZ671-Gal4）、LHより上外側前大脳（taste52に関連）をラベル付けしました（slpr -LH; NP3060-Gal4）、および腹側外側内側前大脳（visual33に関連）からLH（vlpr-LH; NP5194-Gal4）25。結果は、標的とされた脳領域からの投影がLH領域に集まる、またはシナプスを作ることを示し（図5a）、多様な文脈情報がLHに中継されることを示唆しています。

次に、cLTM検索に対するラベル付きニューロンの操作の効果をテストしました。 LHニューロンの各サブグループのシナプス伝達をブロックすると、cLTM検索が廃止されました（図5bおよび補足図5）。ただし、cLTMの取得は、従来のLTM53に必要であると報告されているLHに投射するMB出力ニューロン（MB-V2、NP2492-Gal4でラベル付け）の遮断の影響を受けませんでした。この接続は、文脈に依存しない嫌悪嗅覚記憶の検索に必要な場合があります53,54。したがって、cLTMの検索には、他の異なる感覚脳領域からLHへのシナプス入力の統合も含まれます（図5c）。

これらのLHニューロンが従来のLTMの検索にも関与しているかどうかを判断するために、ブロックしました。間隔を空けたトレーニング後の検索中のこれらのニューロン。このような遮断はLTMに影響を与えませんでした（補足図5b）。

cLTMの検索におけるLHニューロンの役割をさらに検証するために、LH出力ニューロンの遮断の効果をテストしました。 LH出力ニューロンを標識するために多くのGal4株が同定されています44。 PV5b3、AD1d1、AV4b4 / c1、PV5g1 / g2、またはAV6b1でラベル付けされたニューロンからの出力がブロックされた場合（補足図5c）、24時間のcLTMは明らかではありませんでしたが、AD1e1およびAV6a1はブロックされませんでした。これらの観察結果は、LHがcLTM検索で中心的な役割を果たしていることを示しています。

コンテキストに依存しないメモリコンポーネントの報告された研究と一緒に提示されたデータを使用して、cLTMおよびLTM検索のモデルを提案します（図。6）。 LHの多感覚統合は、cLTMの検索可能性をゲートしますが、条件付けされた匂いだけで、コンテキストに依存しない記憶の検索に十分です。