Obnovení měděné mřížky do testovací trubice odhaluje cLTM

Všechny předchozí publikace zahrnující averzivní čichové kondicionování v Drosophile použili přístroje a postupy pro behaviorální analýzu odvozené ze stejného konstrukčního principu10. To znamená, že mouchy jsou trénovány ve výcvikové trubici s povrchem z měděné mřížky, která dodává elektrické šoky (obr. 1a, levý panel), a testovány v testovacích trubicích bez měděné mřížky (obr. 1a, střední panel). V žádné předchozí studii tedy získání averzivních paměťových komponent nevyžadovalo přítomnost měděné mřížky. Když byla měděná mřížka znovu zavedena do testovacích zkumavek (obr. 1a, pravý panel) – postup, který neovlivňuje ostrost zápachu (doplňková tab. 1) nebo nevede k nesprávné funkci paměti (doplňkový obr. 1a), odhalil test chování výrazné účinky. Úprava s jedním pokusem vyprodukovala paměťovou složku závislou na měděné mřížce, která vydržela déle než dříve, a to i v opakovaných opakovaných pokusech. Konkrétně paměť trvala nejméně 14 dní, což bylo nejdelší testované období (obr. 1b).

Abychom zjistili, zda toto vylepšení paměti závislé na měděné mřížce odráží obecné účinky obnovení kontextu, pokusili jsme se změnit další prvky tréninkového prostředí, konkrétně barvu okolního světla a teplotu prostředí za letu jsou schopni reagovat na oba32,33. Když bylo červené testovací světlo při testování přepnuto na žlutou barvu, nebo naopak, došlo k vylepšení paměti, i když byla k dispozici měděná mřížka (obr. 1c a doplňkový obr. 1c). Podobně vylepšení zmizelo, když se testovací teplota výrazně lišila od teploty učení (23 ° C vs. 32 ° C nebo naopak; obr. 1c a doplňkový obr. 1d). Proto změna jakýchkoli podmínek prostředí v kontextu kódování zcela zablokovala paměť závislou na měděné mřížce.

Rozdíl mezi kódovacím prostředím a testovacím prostředím však musel být dostatečně významný nebo snadno zjistitelný, aby ovlivnil načítání paměť závislá na měděné mřížce. Například zlepšení paměti bylo zachováno, když byla testovací teplota změněna z kódovací teploty 23 ° C na testovací teplotu 25 ° C (doplňkový obr. 1e).

V každém případě vyhledávání mědi paměť závislá na mřížce vyžaduje podmíněný zápach a úplné obnovení kontextu prostředí kódování. Proto jsme tuto paměťovou složku nazvali jako kontextově závislou LTM (cLTM).

cLTM nevyžaduje žádnou konsolidaci závislou na syntéze bílkovin

Protože většina studií vyvolala LTM pouze pomocí tréninkových protokolů s mezerami , a protože LTM závisí na syntéze proteinů3, dále jsme určili, zda je pro cLTM nezbytná konsolidace závislá na syntéze proteinů.Je pozoruhodné, že tvorba takové dlouhodobé paměti byla nezávislá na syntéze bílkovin, protože podávání cykloheximidu (CXM), inhibitoru syntézy bílkovin, nemělo žádný vliv na tvorbu cLTM (obr. 1d), zatímco stejná léčba blokovala tvorbu LTM (doplňkový obr. 1f) podle očekávání3,8,9. Na podporu tohoto pozorování nevykázala inhibice syntézy proteinů prostřednictvím neuronální exprese RICIN34, proteinu inaktivujícího eukaryotické ribozomy, v transgenních muškách (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) žádný účinek na tvorbu cLTM (doplňkový obrázek 1g). Tuto nezávislost jsme dále potvrdili prostřednictvím pan-neuronální exprese (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) represorové izoformy proteinu 2 vázajícího prvek cAMP-response element (CREB2b), o kterém se uvádí, že blokuje LTM5 u transgenních mušek, neměl žádný vliv na cLTM ( Obr. 1g). Kromě toho klasické mutanty učení a paměti rutabaga (rut) rut1 a rut2080 s oslabenou syntézou cAMP prováděly normální cLTM (obr. 1h). Prezentovaná data tedy silně naznačují, že tvorba cLTM nevyžaduje žádnou syntézu proteinů, a proto se liší od kontextově nezávislé LTM. cLTM je také odlišitelný od anesteziologicky rezistentní paměti (ARM), protože zůstává normální u mutanta ředkvičky (doplňkový obr. 1h), zatímco ARM je narušen35.

Abychom potvrdili tato překvapivá zjištění, určili jsme, zda tvorba cLTM vyžaduje čas, další známka konsolidace. Za tímto účelem jsme charakterizovali odolnost cLTM vůči léčbě šokem za studena, o níž je známo, že ruší krátkodobou a střednědobou paměť3,8. Dvacet čtyři hodin po tréninku zůstala cLTM nedotčena (obr. 1d) typickým ošetřením šokem za studena. Taková odolnost proti chladovému šoku nám umožnila provést dva následné experimenty:

Nejprve jsme aplikovali ošetření chladovým šokem po dobu 2 minut bezprostředně po jedné studii kondicionování. Po 3 minutách odpočinku od studeného šoku behaviorální test ukázal, že cLTM odolný proti studenému šoku již byl vytvořen v plné síle (asi 20% indexu výkonnosti; obr. 1e). Za druhé, abychom dále ověřili pozorování, snížili jsme sílu cvičného elektrického šoku ze 60 na 20 V, abychom se vyhnuli jakýmkoli stropním účinkům síly paměti. Zjistili jsme, že i při tak slabé tréninkové síle se cLTM vytvořila okamžitě, protože podobná vylepšení byla okamžitě přítomna v paměti, což naznačuje, že tvorba cLTM byla udržována po dlouhou dobu bez úpadku (obr. 1f). CLTM se tedy vytvoří do 3 minut po tréninku, což naznačuje, že pro jeho tvorbu není nutné konsolidace syntézy bílkovin.

Toto překvapivé pozorování nás přimělo prozkoumat, zda se cLTM liší od tradičního LTM, nebo pouze tvoří stejný paměť načtená v různých kontextech prostředí. Několik řádků důkazů, které jsou uvedeny níže, naznačuje, že cLTM je odlišná paměťová složka s různými molekulárními a anatomickými rysy.

Dopaminergní neurony se podílejí na tvorbě cLTM

Tvorba LTM vyžaduje dopaminergní neurony ( DAN), takže jsme zkoumali roli DAN v kódování cLTM a porovnávali 24hodinovou paměť u kontrolních mušek s pamětí u mušek, jejichž synaptické výstupy z DAN byly během tréninku blokovány. Za tímto účelem byla exprese UAS-Shibirets1 (Shits) zacílena na DAN prostřednictvím TH-Gal4, takže normální synaptický výstup byl povolen při přípustných teplotách (23 ° C), ale blokován při omezujících teplotách (32 ° C) 36. Abychom zajistili konzistentní podmínky prostředí mezi tréninkem a testováním, přijali jsme přísný režim pro teplotní ošetření. Konkrétně k blokování synaptického přenosu během tréninku byly mouchy přesunuty do prostředí 32 ° C 30 minut před tréninkem a zpět na 23 ° C bezprostředně před tréninkem. Poté absolvovali výcvik do 5 minut a byli testováni o 24 hodin později při 23 ° C. V daném časovém okně (5 minut) zůstal blokován synaptický přenos neuronů exprimujících Shits (doplňkový obr. 2a). Podobně v případě testů, které vyžadovaly blokování neuronů během testování, byly mouchy před testováním přesunuty do prostředí 32 ° C, ale byly trénovány a testovány při 23 ° C (obr. 2a). Výsledky ukázaly, že blokování uvolňování neurotransmiteru z neuronů značených TH-Gal4 narušilo tvorbu cLTM, což naznačuje, že pro kódování cLTM jsou vyžadovány DAN. Tento závěr byl dále podpořen behaviorálním testem, který ukázal, že k žádným cLTM nedošlo u much majících mutanty Drosophila D1 (dDA1) (dDA1dumb2) 37 nebo u mouch s panneuronální srážkou dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb -Gal4) (obr. 2b). To naznačuje, že neuromodulace zprostředkovaná dDA1 hraje roli při získávání cLTM.

Avšak dDA1 exprimované v MB neuronech nebyly zapojeny do akvizice cLTM, protože cílená nadměrná exprese dDA1 v neuronech MB na pozadí mutantů dDA1dumb2 (dDA1dumb2; OK107-Gal4) nedokázala záchyt cLTM zachránit. V souladu s tím neovlivnil dDA1 knockdown v MB neuronech (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) cLTM. Tato data naznačují, že cLTM je kódována neuromodulací zprostředkovanou dDA1, ale nikoli v MB.

Získání cLTM je nezávislé na neuronech houbových těl

Je zajímavé, že dDA1 v neuronech MB byly není zapojen do získávání cLTM, zatímco všechny předchozí studie v této oblasti zjistily, že tvorba kontextově nezávislých averzivních paměťových komponent, včetně tradičních LTM, zahrnuje MB neurony38,39,40,41. Abychom toto pozorování potvrdili, zkoumali jsme role MB neuronů při získávání cLTM. Za tímto účelem byla exprese UAS-Shits zaměřena na MB neurony prostřednictvím dvou nezávislých budičů Gal4: OK107-Gal4 a C772-Gal4 (doplňkový obr. 2b, c). Ačkoli vyhledávání LTM selhalo u OK107-Gal4; mouchy UAS-Shits (doplňkový obr. 2d), cLTM zůstaly nedotčené u OK107-Gal4; UAS-Shits a C772-Gal4; mouchy UAS-Shits (obr. 2c, d), což potvrzuje, že MB neurony se nepodílejí na tvorbě nebo vyhledávání cLTM.

Načítání cLTM vyžaduje AL a projekční neurony

Abychom zjistili, které oblasti mozku jsou pro získání cLTM potřebné, zkoumali jsme roli AL lokální neurony a projekční neurony (PN). Čichové informace u much se přenášejí ze senzorických neuronů na AL neurony a PN, které se pak rozdvojují na MB a LH42. Nejprve jsme otestovali účinky blokování synaptického výstupu z AL lokálních neuronů značených OK66-Gal4 (doplňkový obr. 3a). Blokování synaptického přenosu při omezující teplotě zrušilo cLTM v OK66-Gal4; UAS-Shits mouchy (obr. 3a). Poté jsme testovali účinky dvou odlišných podskupin projekčních neuronů, přičemž excitační projekční neurony (ePN) vyčnívající jak na MB, tak na LH, označené GH146-Gal4 (doplňkový obr. 3b), a inhibiční projekční neurony (iPN) vyčnívající pouze na oblast LH, označená MZ699-Gal4 (doplňkový obr. 3c). Vylepšení 24hodinové paměti v přítomnosti mřížek nebylo patrné, když byl blokován výstup buď ePN, nebo iPN (obr. 3b, c). Tato pozorování ukazují, že AL neurony a PN se účastní čichového přenosu informací během načítání cLTM, stejně jako u všech dříve identifikovaných kontextově nezávislých paměťových komponent. Naproti tomu iPN označené MZ699-Gal4, které se promítají do LH, jsou vyžadovány pro čichové návyky, ale ne pro načítání kontextově nezávislé paměti28,43. Tento účinek MZ699-Gal4 naznačuje, že LH hraje roli při načítání cLTM.

Získání cLTM vyžaduje neurony LH a AMMC

Je zajímavé, že neurony LH jsou spojeny s několika vzdálenými oblastmi mozku25. Nedávný objev uvádí, že LH přijímá multisenzorické vstupy z oblastí mozku různých senzorických systémů44. Patří mezi ně anténní mechanosenzorické a motorické centrum (AMMC), které sděluje mechanosenzorické informace, ventrální laterální protocerebrum (vlpr), které je zodpovědné za barevné vidění33, a další oblasti spojené s chutí a teplotou32,45.Předpokládali jsme tedy hypotézu, že takové konvergující neuronové spoje zprostředkovávají vyhledávání cLTM pomocí více senzorických modalit.

Abychom tuto hypotézu otestovali, nejprve jsme se zaměřili na podskupinu LH neuronů spojených s AMMC. Toto centrum přijímá různé mechanosenzorické signály z Johnsonových orgánů, včetně hmatu, sluchu, propriocepce a snímání větru46,47,48,49. Poté přenáší tyto signály do dalších oblastí mozku, včetně LH25. Expresní vzorec NP1004-Gal4 byl vizualizován barvením membránového cílového markeru mCD8: GFP v NP1004-Gal4; UAS-mCD8: GFP mouchy (obr. 4a, levý panel). Neurony AMMC-LH značené NP1004-Gal4 a imunoznačením skutečně ukázaly, že presynaptický marker syt :: GFP (fúze eGFP a synaptického peptidu vezikulárního synaptotagminu) je obohacen v LH NP1004-Gal4; Mouchy UAS-syt :: GFP (obr. 4a, pravý panel), což naznačuje, že existují synaptická spojení od AMMC k LH.

Reverzibilní blokáda synaptického přenosu vyvolaná tepelným šokem narušila načítání cLTM v NP1004-Gal4; UAS-Shits mouchy (obr. 4b). Potvrzující toto pozorování, blokování synaptického přenosu v AMMC neuronech značených R38E07-Gal4 a NP0761-Gal4 také potlačilo vyhledávání cLTM (obr. 4c a doplňkový obr. 4c). Tyto výsledky naznačují, že reprezentace mechanosenzorických informací v neuronech AMMC-LH je pro získání cLTM rozhodující. Abychom tento závěr dále potvrdili, blokovali jsme mechanosenzorické vstupy odstraněním aristy, která je hlavním mechanosenzorickým orgánem v Drosophile, po tréninku. Výsledky ukázaly, že tato léčba narušila cLTM (obr. 4d), ale neměla žádný vliv na učení (doplňkový obr. 4d), což naznačuje roli neuronů AMMC-LH v cLTM.

Dále jsme zobrazili odpovědi vápníku v terminál LH neuronů AMMC-LH po mechanosenzorickém stimulu aplikovaném malým štětcem na aristu (viz část Metody). Za tímto účelem jsme exprimovali GCamP6f, na vápník citlivý fluorescenční protein50, řízený NP1004-Gal4. Poté jsme zaznamenali fluorescenci GCamP6f z LH oblastí (obr. 4e). Byly robustní reakce na aristický kontakt s kartáčem v oblasti LH, což podporovalo představu, že mechanosenzorické informace jsou přenášeny na LH prostřednictvím neuronů AMMC-LH. AMMC neuronální aktivita pomocí transkripčního reportéru intracelulárního vápníku (TRIC) 51, který zvyšuje expresi GFP v poměru k hladinám intracelulárního vápníku u much. Fluorescence TRIC z oblasti AMMC byla vypočítána 3 hodiny po získání a normalizována na kontrolu much (obr. 4f). Signifikantně vyšší signál TRIC byl pozorován v AMMC po kontextově závislém načtení než u kontrolních mušek nebo po kontextově nezávislém načtení, což ukazuje, že neuronová aktivita AMMC dobře koreluje s kontextově závislým načtením. Neurony LH jsou tedy schopné integrovat mechanosenzorické informace z AMMC a čichové informace z AL k získání cLTM (obr. 4g).

Multisenzorická integrace v LH je základem načítání cLTM

Poté jsme dále ověřili, zda byly do tohoto procesu zapojeny i další senzorické systémy, například vizuální systém. Blokovali jsme vizuální vstup prostřednictvím cílené exprese teplotně citlivých mutantních Shitů v očích (UAS-Shits; GMR-Gal4) a neuronů optického laloku (UAS-Shits; R82D10-Gal4) během načítání cLTM (doplňkový obr. 6a). cLTM byly zrušeny v obou případech, což naznačuje, že vizuální systém je také zapojen do načítání cLTM.

Takový vizuální vstup i další potenciální senzorické vstupy údajně konvergují k LH neuronům, stejně jako v případě mechanosenzorických vstup. Provedli jsme cílenou expresi presynaptického markeru syt :: GFP na dostupných liniích Gal4, značení následujících LH neuronů, lepší mediální protocerebrum na LH (smpr-LH; MZ671-Gal4), lepší laterální protocerebrum (relevantní pro chuť52) na LH (slpr -LH; NP3060-Gal4) a ventrální laterální mediální protocerebrum (relevantní pro vizuální33) až LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. Výsledky ukázaly, že projekce z cílených oblastí mozku se shromažďují nebo vytvářejí synapse v oblasti LH (obr. 5a), což naznačuje, že do LH jsou přenášeny různé kontextové informace.

Poté jsme testovali účinky manipulace se značenými neurony na vyhledávání cLTM. Blokování synaptického přenosu každé podskupiny LH neuronů zrušilo vyhledávání cLTM (obr. 5b a doplňkový obr. 5). Načítání cLTM však nebylo ovlivněno blokováním výstupních neuronů MB (MB-V2, označených NP2492-Gal4), které se promítají do LH, což bylo údajně vyžadováno pro tradiční LTM53. Toto připojení může být nutné pro načtení kontextově nezávislé averzní čichové paměti53,54. Vyhledávání cLTM tedy zahrnuje také integraci synaptických vstupů z jiných odlišných senzorických oblastí mozku do LH (obr. 5c).

Abychom zjistili, zda jsou tyto LH neurony také zapojeny do vyhledávání tradiční LTM, zablokovali jsme tyto neurony během vyhledávání po rozloženém tréninku. Taková blokáda neměla žádný dopad na LTM (doplňkový obr. 5b).

K dalšímu ověření role LH neuronů při získávání cLTM jsme poté testovali účinky blokování výstupních neuronů LH. Bylo identifikováno mnoho kmenů Gal4 pro označení výstupních neuronů LH44. 24hodinová cLTM nebyla evidentní, když byl blokován výstup z neuronů značených PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 nebo AV6b1 (doplňkový obrázek 5c), zatímco AD1e1 a AV6a1 nebyly. Tato pozorování ukazují, že LH hraje ústřední roli při načítání cLTM.

Vezmeme-li data uvedená společně s hlášenou studií kontextově nezávislých paměťových komponent, jsme vedeni k navržení modelu pro načítání cLTM a LTM (obr. 6). Multisenzorická integrace v LH branách vyhledatelnost cLTM, zatímco při získávání kontextově nezávislých pamětí stačí pouze podmíněný zápach.