Reinstalarea rețelei de cupru în tubul de testare relevă cLTM

care implică condiționarea olfactivă aversivă în Drosophila au folosit aparate de testare comportamentală și proceduri derivate din același principiu de proiectare10. Adică muștele sunt antrenate într-un tub de antrenament cu o suprafață a rețelei de cupru care furnizează șocuri electrice (Fig. 1a, panoul din stânga) și testate în tuburi de testare fără rețeaua de cupru (Fig. 1a, panoul din mijloc). Astfel, în niciun studiu anterior, recuperarea componentelor de memorie aversive nu a necesitat prezența rețelei de cupru. Când grila de cupru a fost reintrodusă în tuburile de testare (Fig. 1a, panoul din dreapta) – o procedură care nu afectează acuitatea mirosului (Tab. 1 suplimentară) sau nu duce la performanțe de memorie falsă (Fig. 1a suplimentară), testul comportamental a dezvăluit efecte izbitoare. Condiționarea cu un singur proces a produs o componentă de memorie dependentă de rețea de cupru, care a susținut mai mult decât cele observate anterior, chiar și în studii repetate distanțate. Mai exact, memoria a durat cel puțin 14 zile, care a fost cea mai lungă perioadă testată (Fig. 1b).

Pentru a determina dacă această îmbunătățire a memoriei dependente de rețeaua de cupru reflectă efectele generale ale reintegrării contextului, am încercat să modificăm alte elemente ale mediului de antrenament, în special culoarea luminii înconjurătoare și temperatura mediului în timp ce muștele sunt capabili să răspundă la ambele32,33. Când lumina roșie de antrenament a fost comutată la galben în timpul testării, sau invers, îmbunătățirea memoriei nu a reușit, chiar și atunci când a fost prevăzută rețeaua de cupru (Fig. 1c și Fig. 1c suplimentară). În mod similar, îmbunătățirea a dispărut atunci când temperatura de testare a fost semnificativ diferită de temperatura de învățare (23 ° C vs. 32 ° C, sau invers; Fig. 1c și Fig. Suplimentară 1d). Prin urmare, schimbarea oricărei condiții de mediu a contextului de codificare a blocat complet memoria de cupru dependentă de rețea.

Cu toate acestea, diferența dintre mediul de codificare și mediul de testare a trebuit să fie suficient de semnificativă sau ușor de detectat pentru a afecta recuperarea memoria de cupru dependentă de rețea De exemplu, îmbunătățirea memoriei a fost păstrată atunci când temperatura de testare a fost schimbată de la o temperatură de codificare de 23 ° C la o temperatură de testare de 25 ° C (Fig. Suplimentară 1e).

În orice caz, recuperarea cuprului memoria dependentă de rețea necesită miros condiționat și reintegrarea completă a contextului de mediu de codificare. Acesta este motivul pentru care am numit această componentă a memoriei ca LTM dependent de context (cLTM).

cLTM nu necesită consolidare dependentă de sinteza proteinelor

Deoarece majoritatea studiilor au obținut LTM doar folosind protocoale de antrenament spațiat și, deoarece LTM depinde de sinteza proteinelor3, am stabilit în continuare dacă este necesară consolidarea dependentă de sinteza proteinelor pentru cLTM.În mod remarcabil, formarea unei astfel de memorii de lungă durată a fost independentă de sinteza proteinelor, deoarece administrarea cicloheximidei (CXM), un inhibitor al sintezei proteinelor, nu a avut niciun impact asupra formării cLTM (Fig. 1d), în timp ce același tratament a blocat formarea LTM (Fig suplimentar) . 1f), conform așteptărilor3,8,9. În sprijinul acestei observații, inhibarea sintezei proteinelor prin expresia pan-neuronală a RICIN34, o ribozomi eucariote inactivatoare de proteine la muștele transgenice (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) nu a prezentat niciun efect asupra formării cLTM (Fig. Suplimentară 1g). Am confirmat această independență în continuare prin expresia pan-neuronală (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) a unei izoforme represoare a proteinei de legare a elementelor de răspuns cAMP 2 (CREB2b) care se raportează că blochează LTM5 la muștele transgenice nu a avut impact asupra cLTM ( Fig. 1g). Mai mult, mutanții clasici de învățare și memorie rutabaga (rut), rut1 și rut2080, cu sinteză cAMP atenuată au efectuat cLTM normal (Fig. 1h). Astfel, datele prezentate sugerează cu tărie că formarea cLTM nu necesită sinteză de proteine și, prin urmare, este diferită de LTM independent de context. cLTM se distinge și de memoria rezistentă la anestezie (ARM), deoarece rămâne normală într-un mutant de ridiche (Fig. suplimentară 1h) în timp ce ARM este afectat35.

Pentru a valida aceste descoperiri surprinzătoare, am stabilit dacă formarea cLTM necesită timp, un alt indiciu al consolidării. În acest scop, am caracterizat rezistența cLTM la tratamentul cu șoc la rece, despre care se știe că elimină memoria pe termen scurt și pe termen mediu3,8. La douăzeci și patru de ore de la antrenament, cLTM a rămas neafectat (Fig. 1d) prin tratamentul tipic cu șoc la rece. O astfel de rezistență la șoc la rece ne-a permis să efectuăm două experimente de urmărire:

În primul rând, am aplicat un tratament la șoc la rece timp de 2 minute imediat după un test de condiționare. După 3 minute de odihnă de la șocul rece, o analiză comportamentală a arătat că cLTM rezistent la șocuri la rece a fost deja format la maximă (aproximativ 20% din indicele de performanță; Fig. 1e). În al doilea rând, pentru a valida în continuare observația, am redus puterea șocului electric de antrenament de la 60 la 20 V pentru a evita orice efect de plafon al puterii memoriei. Am constatat că, chiar și la o forță de antrenament atât de slabă, cLTM s-a format imediat, deoarece îmbunătățiri similare au fost prezente imediat în memorie, indicând faptul că formația cLTM care a fost susținută mult timp fără a se descompune (Fig. 1f) Astfel, cLTM se formează în termen de 3 minute după antrenament, sugerând că nu este necesară consolidarea sintezei proteinelor pentru formarea sa.

Această observație surprinzătoare ne-a determinat să investigăm dacă cLTM este diferit de LTM tradițional sau constituie doar același lucru memoria recuperată în diferite contexte de mediu. Mai multe linii de dovezi, prezentate mai jos, au sugerat că cLTM este o componentă distinctă de memorie cu diferite caracteristici moleculare și anatomice.

Neuronii dopaminergici sunt implicați în formarea cLTM

Formarea LTM necesită neuroni dopaminergici ( DAN), așa că am examinat rolul DAN-urilor în codificarea cLTM, comparând memoria de 24 de ore din muștele de control cu cea din muștele ale căror ieșiri sinaptice de la DAN-uri au fost blocate în timpul antrenamentului. În acest scop, expresia UAS-Shibirets1 (Shits) a fost direcționată către DAN prin TH-Gal4, astfel încât ieșirea sinaptică normală a fost permisă la temperaturi permisive (23 ° C), dar blocată la temperaturi restrictive (32 ° C) 36. Pentru a asigura condiții de mediu consistente între antrenament și testare, am adoptat un regim strict pentru tratamentele la temperatură. Mai exact, pentru a bloca transmisia sinaptică în timpul antrenamentului, muștele au fost mutate într-un mediu de 32 ° C cu 30 de minute înainte de antrenament și înapoi la 23 ° C imediat înainte de antrenament. Apoi au finalizat antrenamentul în 5 minute și au fost testați 24 de ore mai târziu la 23 ° C. În intervalul de timp dat (5 minute), transmisia sinaptică a neuronilor care exprimă rahaturi a rămas blocată (Fig. 2a suplimentară). În mod similar, în cazul testelor care au necesitat blocarea neuronilor în timpul testării, muștele au fost mutate într-un mediu de 32 ° C înainte de testare, dar au fost antrenate și testate la 23 ° C (Fig. 2a). Rezultatele au arătat că blocarea eliberării neurotransmițătorului de la neuronii etichetați cu TH-Gal4 afectează formarea cLTM, sugerând că DAN-urile sunt necesare pentru codificarea cLTM. Această concluzie a fost susținută și de testarea comportamentală, care a arătat că nu a apărut nicio cLTM la muștele mutante ale receptorilor de dopamină Drosophila D1 (dDA1) (dDA1dumb2) 37 sau la muștele cu eliminare pan-neuronală a dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb -Gal4) (Fig. 2b). Acest lucru sugerează că neuromodularea mediată de dDA1 joacă un rol în achiziția cLTM.

Cu toate acestea, dDA1s exprimate în neuronii MB nu au fost implicați în achiziția cLTM, deoarece supraexprimarea țintită a dDA1 în neuronii MB pe un fundal mutant dDA1dumb2 (dDA1dumb2; OK107-Gal4) nu a reușit să salveze achiziția cLTM. În concordanță cu aceasta, eliminarea dDA1 în neuronii MB (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) nu a afectat cLTM. Aceste date sugerează că cLTM este codificat de neuromodulare mediată de dDA1, dar nu și în MB. nu este implicat în achiziția cLTM, în timp ce toate studiile anterioare din acest domeniu au constatat că formarea componentelor de memorie aversive independente de context, inclusiv LTM tradițional, implică neuroni MB38,39,40,41. Pentru a confirma această observație, am examinat rolurile neuronilor MB în recuperarea cLTM. În acest scop, expresia UAS-Shits a fost direcționată către neuronii MB prin intermediul a doi factori independenți Gal4: OK107-Gal4 și C772-Gal4 (Fig. Suplimentară 2b, c). Deși recuperarea LTM a eșuat în OK107-Gal4; UAS-Shits zboară (Fig. 2d suplimentar), cLTM a rămas intact în OK107-Gal4; UAS-Shits și C772-Gal4; UAS-Shits zboară (Fig. 2c, d), confirmând că Neuronii MB nu sunt implicați în formarea sau recuperarea cLTM.

Recuperarea cLTM necesită neuroni AL și proiecție

Pentru a identifica regiunile cerebrale care sunt necesare pentru recuperarea cLTM, am investigat rolul AL neuroni locali și neuroni de proiecție (PN). Informațiile olfactive din muște sunt transmise de la neuroni senzoriali la neuroni AL și PN care apoi se bifurcă la MB și LH42. Am testat mai întâi efectele blocării ieșirii sinaptice de la neuronii locali AL marcați de OK66-Gal4 (Fig. Suplimentară 3a). Blocarea transmisiei sinaptice la temperatura restrictivă a abolit cLTM în OK66-Gal4; UAS-Shits fly (Fig. 3a). Am testat apoi efectele a două subgrupuri distincte de neuroni de proiecție, cu neuroni de proiecție excitatorii (ePN) care se proiectează atât către MB cât și către LH, etichetați de GH146-Gal4 (Fig. Suplimentară 3b), și neuronii de proiecție inhibitori (iPN) care se proiectează numai către regiunea LH, marcată cu MZ699-Gal4 (Fig. suplimentară 3c). Îmbunătățirea memoriei de 24 de ore în prezența grilelor nu a fost evidentă când ieșirea fie a ePN-urilor, fie a iPN-urilor a fost blocată (Fig. 3b, c). Aceste observații demonstrează că neuronii AL și PN participă la transmiterea informației olfactive în timpul recuperării cLTM, ca și în cazul tuturor componentelor de memorie independente de context identificate anterior. În schimb, iPN-urile etichetate cu MZ699-Gal4, care se proiectează către LH, sunt necesare pentru obișnuința olfactivă, dar nu pentru recuperarea memoriei independente de context28,43. Acest efect al MZ699-Gal4 implică faptul că LH joacă un rol în recuperarea cLTM.

Recuperarea cLTM necesită neuroni LH și AMMC

Interesant, neuronii LH sunt conectați la mai multe regiuni cerebrale îndepărtate25. O descoperire recentă raportează că LH primește intrări multisenzoriale din regiunile cerebrale ale diferitelor sisteme senzoriale44. Acestea includ centrul mecanic senzorial și motor antenal (AMMC), care comunică informații mecanosenzoriale, protocerebrul lateral ventral (vlpr), care este responsabil pentru viziunea culorii33 și alte zone implicate în gust și temperatură32,45.Am emis astfel ipoteza că astfel de conexiuni neuronale convergente mediază recuperarea cLTM utilizând mai multe modalități senzoriale.

Pentru a testa această ipoteză, ne-am concentrat mai întâi pe un subgrup de neuroni LH legați de AMMC. Acest centru primește diverse semnale mecanosenzoriale de la organul lui Johnson, inclusiv atingerea, auzul, propriocepția și detectarea vântului46,47,48,49. Apoi, transmite aceste semnale către alte regiuni ale creierului, inclusiv LH25. Modelul de expresie al NP1004-Gal4 a fost vizualizat prin colorarea markerului țintă membrana mCD8: GFP în NP1004-Gal4; UAS-mCD8: GFP zboară (Fig. 4a, panoul din stânga). Într-adevăr, neuronii AMMC-LH etichetați cu NP1004-Gal4 și imunocolorați au arătat că markerul presinaptic syt :: GFP (o fuziune a eGFP și sinaptotagminul proteinei veziculei sinaptice) este îmbogățit în LH-ul NP1004-Gal4; UAS-syt :: GFP zboară (Fig. 4a, panoul din dreapta), sugerând că există conexiuni sinaptice de la AMMC la LH.

Blocarea reversibilă indusă de șocul termic al transmisiei sinaptice a afectat recuperarea cLTM în NP1004-Gal4; UAS-Shits fly (Fig. 4b). Coroborând această observație, blocada transmisiei sinaptice în neuronii AMMC etichetați cu R38E07-Gal4 și NP0761-Gal4 a suprimat, de asemenea, recuperarea cLTM (Fig. 4c și Fig. Suplimentară 4c). Aceste rezultate sugerează că reprezentarea informațiilor mecanosenzoriale în neuronii AMMC-LH este critică pentru recuperarea cLTM. Pentru a confirma în continuare această concluzie, am blocat intrările mecanosenzoriale prin eliminarea arista, care este un organ mecanosenzorial major în Drosophila, după antrenament. Rezultatele au arătat că acest tratament a afectat cLTM (Fig. 4d), dar nu a avut niciun impact asupra învățării (Fig. 4d suplimentar), sugerând un rol pentru neuronii AMMC-LH în cLTM.

În continuare, am imaginat răspunsurile de calciu în terminalul LH al neuronilor AMMC-LH după stimul mecanosenzorial aplicat cu o perie mică pe arista (vezi secțiunea Metode). În acest scop, am exprimat GCamP6f, o proteină fluorescentă sensibilă la calciu50, condusă de NP1004-Gal4. Am înregistrat apoi fluorescența GCamP6f din regiunile LH (Fig. 4e). Au existat răspunsuri solide la contactul arista cu pensula în regiunea LH, susținând ideea că informațiile mecanosenzoriale sunt transmise către LH prin intermediul neuronilor AMMC-LH. Activitatea neuronală AMMC utilizând reporterul transcripțional al calciului intracelular (TRIC) 51, care crește expresia GFP proporțional cu nivelurile de calciu intracelular la muște. Fluorescența TRIC din regiunea AMMC a fost calculată la 3 ore după recuperare și normalizată pentru a controla muștele (Fig. 4f). Semnal TRIC semnificativ mai mare a fost observat în AMMC după recuperarea dependentă de context decât în muștele de control sau după recuperarea independentă de context, arătând că activitatea neuronală AMMC se corelează bine cu recuperarea dependentă de context. Astfel, neuronii LH sunt capabili să integreze informații mecanosenzoriale din AMMC și informații olfactive din AL pentru a extrage cLTM (Fig. 4g).

Integrarea multisenzorială în LH stă la baza recuperării cLTM

Am verificat apoi dacă și alte sisteme senzoriale au fost implicate în acest proces, cum ar fi sistemul vizual. Am blocat intrarea vizuală prin expresia țintită a mutărilor sensibile la temperatură în ochi (UAS-Shits; GMR-Gal4) și a neuronilor lobului optic (UAS-Shits; R82D10-Gal4) în timpul recuperării cLTM (Fig. Suplimentară 6a). cLTM au fost abolite în ambele cazuri, sugerând că sistemul vizual este, de asemenea, implicat în recuperarea cLTM.

O astfel de intrare vizuală, precum și alte potențiale intrări senzoriale converge în neuroni LH, la fel ca în cazul mecanosenzorială. intrare. Am efectuat expresia țintită a markerului presinaptic syt :: GFP în liniile disponibile Gal4, marcând următorii neuroni LH, protocerebrum medial superior la LH (smpr-LH; MZ671-Gal4), protocerebrum lateral superior (relevant pentru taste52) la LH (slpr -LH; NP3060-Gal4) și protocerebrum lateral medial ventral (relevant pentru visual33) la LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. Rezultatele au arătat că proiecțiile din regiunile cerebrale vizate se adună sau fac sinapse în regiunea LH (Fig. 5a), sugerând că diverse informații contextuale sunt transmise către LH.

Am testat apoi efectele manipulării neuronilor marcați asupra recuperării cLTM. Blocarea transmisiei sinaptice a fiecărui subgrup de neuroni LH a abolit recuperarea cLTM (Fig. 5b și Fig. Suplimentară 5). Cu toate acestea, recuperarea cLTM nu a fost afectată de blocarea neuronilor de ieșire MB (MB-V2, etichetați de NP2492-Gal4) care se proiectează către LH, care a fost raportată necesară pentru LTM53 tradițional. Această conexiune poate fi necesară pentru recuperarea memoriei olfactive aversive independente de context53,54. Astfel, recuperarea cLTM implică și integrarea intrărilor sinaptice din alte regiuni senzoriale distincte ale creierului în LH (Fig. 5c).

Pentru a determina dacă acești neuroni LH sunt implicați și în regăsirea LTM tradițional, am blocat acești neuroni în timpul recuperării după antrenament la distanță. O astfel de blocare nu a exercitat niciun impact asupra LTM (Fig. Suplimentară 5b).

Pentru a valida în continuare un rol al neuronilor LH în recuperarea cLTM, am testat apoi efectele blocării neuronilor de ieșire LH. Un număr de tulpini Gal4 sunt identificate pentru a marca neuronii de ieșire LH44. CLTM de 24 de ore nu a fost evident când ieșirea din neuronii etichetați de PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 sau AV6b1 a fost blocată (Fig. Suplimentară 5c), în timp ce AD1e1 și AV6a1 nu au fost. Aceste observații demonstrează că LH joacă un rol central în recuperarea cLTM.

Luând datele prezentate împreună cu studiul raportat al componentelor de memorie independente de context, suntem conduși să propunem un model pentru recuperarea cLTM și LTM (Fig. 6). Integrarea multisenzorială în porțile LH permite recuperarea cLTM în timp ce mirosul condiționat singur este suficient în recuperarea amintirilor independente de context.