Genindføring af kobbergitteret i reagensglas afslører cLTM

Alle tidligere publikationer involverer aversiv olfaktorisk konditionering i Drosophila har brugt adfærdsmæssige analyseapparater og procedurer afledt af det samme designprincip10. Fluerne trænes i et træningsrør med en kobbergitteroverflade, der leverer elektriske stød (fig. 1a, venstre panel) og testes i testrør uden kobbergitteret (fig. 1a, midterpanel). Således har hentning af aversive hukommelseskomponenter i ingen tidligere undersøgelser krævet tilstedeværelsen af kobbergitteret. Da kobbergitteret blev genindført i testrørene (fig. 1a, højre panel) – en procedure, der ikke påvirker lugtstyrke (supplerende tab. 1) eller fører til falsk hukommelsesydelse (supplerende fig. 1a), afslørede adfærdsmæssig analyse slående effekter. Enkelt-prøve-konditionering producerede en kobber-gitterafhængig hukommelseskomponent, der opretholdt længere tid end dem, der tidligere blev set, selv i gentagne forsøg med adskilte afstand. Specifikt varede hukommelsen i mindst 14 dage, hvilket var den længste testede periode (fig. 1b).

For at bestemme, om denne kobbergitterafhængige hukommelsesforbedring afspejler de generelle virkninger af genoprettelse af kontekst, forsøgte vi at ændre andre elementer i træningsmiljøet, specifikt farven på det omgivende lys og omgivelsestemperaturen som fluer er i stand til at reagere på begge32,33. Da det røde træningslys blev skiftet til gult ved testning, eller omvendt, kunne der ikke opstå hukommelsesforbedring, selv når kobbergitteret blev leveret (fig. 1c og supplerende fig. 1c). Tilsvarende forsvandt forbedring, når testtemperaturen var markant forskellig fra indlæringstemperaturen (23 ° C vs. 32 ° C, eller omvendt; fig. 1c og supplerende figur 1d). Ændring af en hvilken som helst miljøtilstand i kodningskonteksten blokerede derfor kobbergitterafhængig hukommelse fuldstændigt.

Forskellen mellem kodningsmiljøet og testmiljøet måtte imidlertid være tilstrækkelig signifikant eller let detekterbar til at påvirke hentning af den kobbergitterafhængige hukommelse. For eksempel blev hukommelsesforbedring bevaret, når testtemperaturen blev ændret fra en kodende temperatur på 23 ° C til en testtemperatur på 25 ° C (supplerende figur 1e).

Under alle omstændigheder hentning af kobber gitterafhængig hukommelse kræver konditioneret lugt og fuld genindføring af den kodende miljømæssige kontekst. Dette er grunden til, at vi kaldte denne hukommelseskomponent som kontekstafhængig LTM (cLTM).

cLTM kræver ingen proteinsynteseafhængig konsolidering

Da de fleste undersøgelser kun har fremkaldt LTM ved hjælp af adskilte træningsprotokoller og fordi LTM afhænger af proteinsyntese3, bestemte vi yderligere, om proteinsyntese-afhængig konsolidering er nødvendig for cLTM.Bemærkelsesværdigt var dannelse af sådan en langvarig hukommelse uafhængig af proteinsyntese, fordi administration af cycloheximid (CXM), en proteinsynteseinhibitor, ikke havde nogen indvirkning på cLTM-dannelse (fig. 1d), mens den samme behandling blokerede LTM-dannelse (supplerende . 1f) som forventet3,8,9. Til støtte for denne observation viste inhibering af proteinsyntese gennem pan-neuronal ekspression af RICIN34, et protein, der inaktiverede eukaryote ribosomer, i transgene fluer (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) heller ingen effekt på cLTM-dannelse (Supplerende fig. 1g). Vi bekræftede en sådan uafhængighed yderligere gennem pan-neuronal ekspression (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) af en repressor-isoform af cAMP-respons-element-bindende protein 2 (CREB2b), der rapporteres at blokere LTM5 i transgene fluer, havde ingen indflydelse på cLTM ( Fig. 1g). Desuden udførte klassisk læring og hukommelse rutabaga (rut) mutanter, rut1 og rut2080 med svækket cAMP-syntese normal cLTM (fig. 1h). Data, der præsenteres, antyder således stærkt, at cLTM-dannelse ikke kræver proteinsyntese og derfor er forskellig fra den kontekstuafhængige LTM. cLTM kan også skelnes fra anæstesiresistent hukommelse (ARM), for det forbliver normalt i en radise-mutant (supplerende fig. 1h), mens ARM er svækket35.

For at validere disse overraskende fund besluttede vi, om dannelsen af cLTM tager tid, en anden indikation af konsolidering. Til dette formål karakteriserede vi modstanden fra cLTM mod koldstødsbehandling, som er kendt for at afskaffe kort- og mellemhukommelse3,8. Fireogtyve timer efter træning forblev cLTM upåvirket (fig. 1d) af typisk koldstødsbehandling. En sådan modstand mod koldstød tillod os at udføre to opfølgningseksperimenter:

For det første anvendte vi koldstødsbehandling i 2 minutter umiddelbart efter et konditioneringsforsøg. Efter 3 minutters hvile fra det kolde chok viste en adfærdsmæssig analyse, at den koldstødsresistente cLTM allerede var dannet i fuld styrke (ca. 20% af det udførende indeks; fig. 1e). For det andet, for yderligere at validere observationen, reducerede vi styrken af træningselektrisk stød fra 60 til 20 V for at undgå eventuelle lofteffekter af hukommelsesstyrke. Vi fandt ud af, at selv ved en så svag træningsstyrke blev cLTM dannet med det samme, fordi lignende forbedringer straks var til stede i hukommelsen, hvilket indikerer, at cLTM-dannelse, der blev opretholdt i lang tid uden at henfalde (fig. 1f). Således dannes cLTM inden for 3 minutter efter træning, hvilket antyder, at der ikke kræves nogen proteinsyntese-konsolidering for dets dannelse.

Denne overraskende observation fik os til at undersøge, om cLTM er forskellig fra traditionel LTM eller blot udgør den samme hukommelse hentet i forskellige miljømæssige sammenhænge. Flere beviser, præsenteret nedenfor, antydede, at cLTM er en særskilt hukommelseskomponent med forskellige molekylære og anatomiske træk.

Dopaminerge neuroner er involveret i cLTM-dannelse

LTM-dannelse kræver dopaminerge neuroner ( DAN’er), så vi undersøgte DAN’ernes rolle i cLTM-kodning, idet vi sammenlignede 24-timers hukommelse i kontrolfluer med fluer, hvis synaptiske output fra DAN’er blev blokeret under træning. Til dette formål blev ekspression af UAS-Shibirets1 (Shits) målrettet mod DAN’er gennem TH-Gal4, så normal synaptisk output blev tilladt ved tilladelige temperaturer (23 ° C) men blokeret ved restriktive temperaturer (32 ° C) 36. For at sikre ensartede miljøforhold mellem træning og test vedtog vi en streng ordning for temperaturbehandlinger. Specifikt for at blokere synaptisk transmission under træning blev fluer flyttet ind i et 32 ° C miljø 30 minutter før træning og tilbage til 23 ° C umiddelbart før træning. De afsluttede derefter træning inden for 5 minutter og blev testet 24 timer senere ved 23 ° C. Inden for det givne tidsvindue (5 min) forblev synaptisk transmission af neuroner, der udtrykker shits, blokeret (supplerende figur 2a). Tilsvarende i tilfælde af assays, der krævede neuronblokade under testning, blev fluer flyttet til et 32 ° C miljø før test, men blev trænet og testet ved 23 ° C (fig. 2a). Resultaterne viste, at blokering af frigivelsen af neurotransmitter fra TH-Gal4-mærkede neuroner forringede cLTM-dannelse, hvilket antyder, at der kræves DAN’er til cLTM-kodning. Denne konklusion blev yderligere understøttet af det adfærdsmæssige assay, som viste, at der ikke forekom nogen cLTM i Drosophila D1 dopaminreceptoren (dDA1) -mutante fluer (dDA1dumb2) 37 eller i fluer med pan-neuronal nedbrydning af dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb -Gal4) (fig. 2b). Dette antyder, at dDA1-medieret neuromodulation spiller en rolle i cLTM-erhvervelse.

DDA1’er udtrykt i MB-neuroner var imidlertid ikke involveret i cLTM-erhvervelse, fordi målrettet overekspression af dDA1 i MB-neuroner på en dDA1dumb2-mutantbaggrund (dDA1dumb2; OK107-Gal4) undlod at redde cLTM-erhvervelse. I overensstemmelse med dette påvirkede dDA1-knockdown i MB-neuroner (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) ikke cLTM. Disse data antyder, at cLTM er kodet af dDA1-medieret neuromodulation, men ikke i MB. ikke involveret i cLTM-erhvervelse, mens alle tidligere undersøgelser inden for dette felt har fundet ud af, at dannelse af kontekstuafhængige, aversive hukommelseskomponenter, herunder traditionel LTM, involverer MB-neuroner38,39,40,41. For at bekræfte denne observation undersøgte vi MB-neuronernes roller i cLTM-hentning. Til dette formål blev ekspression af UAS-Shits målrettet mod MB-neuroner gennem to uafhængige Gal4-drivere: OK107-Gal4 og C772-Gal4 (Supplerende figur 2b, c). Selvom LTM-hentning mislykkedes i OK107-Gal4; UAS-Shits-fluer (supplerende fig. 2d), forblev cLTM intakt i OK107-Gal4; UAS-Shits og C772-Gal4; UAS-Shits fluer (fig. 2c, d), hvilket bekræftede, at MB-neuroner er ikke involveret i dannelsen eller hentningen af cLTM.

Hentning af cLTM kræver AL- og projektionsneuroner

For at identificere, hvilke hjerneområder der kræves til cLTM-hentning, undersøgte vi AL lokale neuroner og projektionsneuroner (PN’er). Olfaktorisk information i fluer videregives fra sensoriske neuroner til AL-neuroner og PN’er, som derefter splitter sig til MB og LH42. Vi testede først virkningerne af at blokere det synaptiske output fra AL lokale neuroner mærket af OK66-Gal4 (supplerende figur 3a). Blokering af synaptisk transmission ved restriktiv temperatur afskaffede cLTM i OK66-Gal4; UAS-Shits fluer (fig. 3a). Vi testede derefter virkningerne af to forskellige undergrupper af projektionsneuroner, med exciterende projektionsneuroner (ePN’er), der projicerer til både MB og LH, mærket af GH146-Gal4 (Supplerende figur 3b) og hæmmende projektionsneuroner (iPN’er), der kun projicerer til LH-regionen mærket af MZ699-Gal4 (supplerende fig. 3c). 24-timers hukommelsesforbedring i nærvær af gitre var ikke tydelig, når output fra hverken ePN’er eller iPN’er blev blokeret (fig. 3b, c). Disse observationer viser, at AL-neuroner og PN’er deltager i olfaktorisk informationsoverførsel under cLTM-hentning, som med alle tidligere identificerede kontekstuafhængige hukommelseskomponenter. I modsætning hertil kræves iPN’er mærket med MZ699-Gal4, der projicerer til LH, til olfaktorisk tilvænning, men ikke hentning af kontekstuafhængig hukommelse28,43. Denne effekt af MZ699-Gal4 indebærer, at LH spiller en rolle i cLTM-hentning.

Hentning af cLTM kræver LH- og AMMC-neuroner

Interessant nok er LH-neuroner forbundet til flere fjerntliggende hjerneområder25. En nylig opdagelse rapporterer, at LH modtager multisensoriske input fra hjerneområder i forskellige sensoriske systemer44. Disse inkluderer det antennemekaniske sensoriske og motoriske center (AMMC), der kommunikerer mekanosensorisk information, det ventrale laterale protocerebrum (vlpr), som er ansvarligt for farvesyn33 og andre områder, der er involveret i smag og temperatur32,45.Vi antog således, at sådanne konvergerende neuronale forbindelser formidler cLTM-hentning ved hjælp af flere sensoriske modaliteter.

For at teste denne hypotese fokuserede vi først på en undergruppe af LH-neuroner knyttet til AMMC. Dette center modtager forskellige mekanosensoriske signaler fra Johnsons organ, herunder berøring, hørelse, proprioception og vindfølelse46,47,48,49. Det videresender derefter disse signaler til andre hjerneområder, herunder LH25. Ekspressionsmønsteret for NP1004-Gal4 blev visualiseret ved farvning af membranmålmarkøren mCD8: GFP i NP1004-Gal4; UAS-mCD8: GFP flyver (fig. 4a, venstre panel). Faktisk viste AMMC-LH-neuroner mærket af NP1004-Gal4 og immunfarvning, at den presynaptiske markør syt :: GFP (en fusion af eGFP og synaptisk vesikelproteinsynaptotagmin) er beriget inden i LH af NP1004-Gal4; UAS-syt :: GFP flyver (fig. 4a, højre panel), hvilket antyder at der er synaptiske forbindelser fra AMMC til LH.

Varmechok-induceret reversibel blokering af synaptisk transmission nedsat cLTM-hentning i NP1004-Gal4; UAS-Shits fluer (fig. 4b). Bekræftelse af denne observation undertrykte blokade af synaptisk transmission i AMMC-neuroner mærket med R38E07-Gal4 og NP0761-Gal4 også cLTM-hentning (fig. 4c og supplerende fig. 4c). Disse resultater antyder, at repræsentationen af mekanosensorisk information inden for AMMC-LH-neuroner er kritisk for cLTM-hentning. For yderligere at bekræfte denne konklusion blokerede vi mekanosensoriske input via fjernelse af arista, som er et vigtigt mekanosensorisk organ i Drosophila, efter træning. Resultaterne viste, at denne behandling svækkede cLTM (fig. 4d), men ikke havde nogen indvirkning på læring (supplerende fig. 4d), hvilket antydede en rolle for AMMC-LH-neuroner i cLTM.

Dernæst afbildede vi calciumrespons i LH-terminalen af AMMC-LH-neuroner efter mekanosensorisk stimulus påført med en lille børste på aristaen (se afsnittet Metoder). Til dette formål udtrykte vi GCamP6f, et calciumfølsomt fluorescerende protein50, drevet af NP1004-Gal4. Vi registrerede derefter fluorescensen af GCamP6f fra LH-regionerne (fig. 4e). Der var robuste svar på arista-kontakt med børsten i LH-regionen, hvilket understøtter forestillingen om, at mekanosensorisk information videresendes til LH gennem AMMC-LH-neuroner.

For at bekræfte, at disse observationer var adfærdsmæssigt signifikante, overvågede vi AMMC neuronal aktivitet ved hjælp af den transkriptionelle reporter af intracellulært calcium (TRIC) 51, hvilket øger GFP-ekspression i forhold til intracellulært calciumniveauer i fluer. Fluorescensen af TRIC fra AMMC-regionen blev beregnet 3 timer efter hentning og normaliseret til kontrol af fluer (fig. 4f). Signifikant større TRIC-signal blev observeret i AMMC efter kontekstafhængig hentning end i kontrolfluerne eller efter kontekstuafhængig hentning, hvilket viser, at AMMC-neuronal aktivitet korrelerer godt med kontekstafhængig hentning. Således er LH-neuroner i stand til at integrere mekanosensorisk information fra AMMC og lugtinformation fra AL for at hente cLTM (fig. 4g).

Multisensorisk integration i LH ligger bag cLTM-hentning

Vi bekræftede derefter yderligere, om andre sensoriske systemer også var involveret i denne proces, såsom det visuelle system. Vi blokerede visuelt input gennem målrettet ekspression af temperaturfølsomme mutante shits i øjnene (UAS-Shits; GMR-Gal4) og de optiske lapneuroner (UAS-Shits; R82D10-Gal4) under cLTM-hentning (supplerende figur 6a). cLTM blev afskaffet i begge tilfælde, hvilket antyder, at det visuelle system også er involveret i cLTM-hentning.

Sådan visuel input såvel som andre potentielle sensoriske input konvergerer angiveligt til LH-neuroner, ligesom i tilfælde af mekanosensorisk input. Vi udførte målrettet ekspression af det presynaptiske markørsystem :: GFP i tilgængelige Gal4-linjer, mærkning af følgende LH-neuroner, overlegen medial protocerebrum til LH (smpr-LH; MZ671-Gal4), overlegen lateral protocerebrum (relevant for smag 52) til LH -LH; NP3060-Gal4) og ventral lateral medial protocerebrum (relevant for visual33) til LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. Resultaterne viste, at fremskrivninger fra målrettede hjerneregioner samles eller foretager synapser i LH-regionen (fig. 5a), hvilket antyder, at forskellig kontekstuel information videresendes til LH.

Vi testede derefter virkningerne af at manipulere de mærkede neuroner på cLTM-hentning. Blokering af synaptisk transmission af hver undergruppe af LH-neuroner afskaffede cLTM-hentning (figur 5b og supplerende figur 5). Imidlertid blev cLTM-hentning ikke påvirket af blokade af MB-outputneuroner (MB-V2, mærket af NP2492-Gal4), der projekterede til LH, hvilket blev rapporteret krævet til traditionel LTM53. Denne forbindelse kan være nødvendig for at hente kontekstuafhængig aversiv olfaktorisk hukommelse53,54. Således involverer cLTM-hentning også integration af synaptiske input fra andre forskellige sensoriske hjerneområder til LH (fig. 5c).

For at bestemme, om disse LH-neuroner også er involveret i hentning af den traditionelle LTM, blokerede vi disse neuroner under hentning efter afstandstræning. En sådan blokade udøvede ingen indflydelse på LTM (supplerende fig. 5b).

For yderligere at validere en rolle som LH-neuroner i hentning af cLTM testede vi derefter virkningerne af at blokere LH-outputneuroner. Et antal Gal4-stammer identificeres for at mærke LH-outputneuroner44. 24-timers cLTM var ikke tydelig, når output fra neuroner mærket af PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 eller AV6b1 blev blokeret (supplerende figur 5c), mens AD1e1 og AV6a1 ikke var. Disse observationer viser, at LH spiller en central rolle i cLTM-hentning.

Når vi tager de data, der præsenteres sammen med den rapporterede undersøgelse af kontekstuafhængige hukommelseskomponenter, føres vi til at foreslå en model til cLTM- og LTM-hentning (fig. 6). Multisensorisk integration i LH-portene cLTM’s hentbarhed, mens konditioneret lugt alene er tilstrækkelig til hentning af kontekstuafhængige minder.