La reinstalación de la rejilla de cobre en el tubo de ensayo revela cLTM

Todas las publicaciones anteriores que implican condicionamiento olfativo aversivo en Drosophila han utilizado aparatos de ensayo de comportamiento y procedimientos derivados del mismo principio de diseño10. Es decir, las moscas se entrenan en un tubo de entrenamiento con una superficie de rejilla de cobre que administra descargas eléctricas (Fig. 1a, panel izquierdo) y se prueban en tubos de ensayo sin la rejilla de cobre (Fig. 1a, panel central). Por lo tanto, en ningún estudio previo la recuperación de componentes de memoria aversivos requirió la presencia de la red de cobre. Cuando se reinstaló la rejilla de cobre en los tubos de ensayo (Fig.1a, panel derecho), un procedimiento que no afecta la agudeza del olor (Tab.1 complementario) ni conduce a un rendimiento de memoria falsa (Fig.1a complementario), el ensayo de comportamiento reveló efectos llamativos. El acondicionamiento de prueba única produjo un componente de memoria dependiente de la red de cobre que se mantuvo más tiempo que los vistos anteriormente, incluso en pruebas repetidas y espaciadas. Específicamente, la memoria duró al menos 14 días, que fue el período más largo probado (Fig. 1b).

Para determinar si esta mejora de la memoria dependiente de la red de cobre refleja los efectos generales del restablecimiento del contexto, intentamos alterar otros elementos del entorno de entrenamiento, específicamente el color de la luz circundante y la temperatura ambiental como moscas son capaces de responder a ambos32,33. Cuando la luz de entrenamiento roja se cambió a amarilla en la prueba, o viceversa, no se produjo la mejora de la memoria, incluso cuando se proporcionó la rejilla de cobre (Fig. 1c y Fig. 1c complementaria). De manera similar, la mejora desapareció cuando la temperatura de prueba fue marcadamente diferente de la temperatura de aprendizaje (23 ° C frente a 32 ° C, o viceversa; Fig. 1c y Fig. 1d complementaria). Por lo tanto, cambiar cualquier condición ambiental del contexto de codificación bloqueó completamente la memoria dependiente de la red de cobre.

Sin embargo, la diferencia entre el entorno de codificación y el entorno de prueba tenía que ser lo suficientemente significativa o fácilmente detectable para afectar la recuperación de la memoria dependiente de la red de cobre. Por ejemplo, la mejora de la memoria se conservó cuando la temperatura de prueba se cambió de una temperatura de codificación de 23 ° C a una temperatura de prueba de 25 ° C (Fig. 1e complementaria).

En cualquier caso, la recuperación de cobre La memoria dependiente de la red requiere un olor acondicionado y un restablecimiento completo del contexto ambiental de codificación. Es por eso que denominamos a este componente de memoria como LTM dependiente del contexto (cLTM).

cLTM no requiere consolidación dependiente de la síntesis de proteínas

Dado que la mayoría de los estudios solo han obtenido LTM usando protocolos de entrenamiento espaciados , y dado que LTM depende de la síntesis de proteínas3, determinamos además si la consolidación dependiente de la síntesis de proteínas es necesaria para cLTM.Sorprendentemente, la formación de una memoria tan duradera fue independiente de la síntesis de proteínas, porque la administración de cicloheximida (CXM), un inhibidor de la síntesis de proteínas, no tuvo ningún impacto en la formación de cLTM (Fig.1d), mientras que el mismo tratamiento bloqueó la formación de LTM (Fig. . 1f), como se esperaba3,8,9. En apoyo de esta observación, la inhibición de la síntesis de proteínas a través de la expresión panneuronal de RICIN34, una proteína que inactiva los ribosomas eucariotas, en moscas transgénicas (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) tampoco mostró ningún efecto sobre la formación de cLTM (Fig. 1g complementaria). Confirmamos dicha independencia aún más a través de la expresión panneuronal (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) de una isoforma represora de la proteína 2 de unión al elemento de respuesta a AMPc (CREB2b) que se informa que bloquea LTM5 en moscas transgénicas no tuvo impacto en cLTM ( Figura 1g). Además, los mutantes de rutabaga (rutina) de aprendizaje y memoria clásicos, rut1 y rut2080, con síntesis de AMPc atenuada realizaron cLTM normal (Fig. 1h). Por lo tanto, los datos presentados sugieren fuertemente que la formación de cLTM no requiere síntesis de proteínas y, por lo tanto, es diferente de la LTM independiente del contexto. cLTM también se distingue de la memoria resistente a la anestesia (ARM) porque permanece normal en un mutante de rábano (Fig. Suplementaria 1h) mientras que ARM está alterado35.

Para validar estos hallazgos sorprendentes, determinamos si la formación de cLTM lleva tiempo, otra indicación de consolidación. Con este fin, caracterizamos la resistencia de cLTM al tratamiento de choque frío, que se sabe que elimina la memoria a corto y medio plazo3,8. Veinticuatro horas después del entrenamiento, cLTM no se vio afectado (Fig. 1d) por el tratamiento típico de choque frío. Tal resistencia al choque frío nos permitió realizar dos experimentos de seguimiento:

En primer lugar, aplicamos el tratamiento de choque frío durante 2 minutos inmediatamente después de una prueba de acondicionamiento. Después de 3 minutos de reposo del choque frío, un ensayo de comportamiento mostró que el cLTM resistente al choque frío ya se había formado con toda su fuerza (aproximadamente el 20% del índice de rendimiento; Fig. 1e). En segundo lugar, para validar aún más la observación, redujimos la fuerza de la descarga eléctrica de entrenamiento de 60 a 20 V para evitar cualquier efecto de techo de la fuerza de la memoria. Descubrimos que, incluso con una fuerza de entrenamiento tan débil, cLTM se formó inmediatamente, porque mejoras similares estaban presentes inmediatamente en la memoria, lo que indica que la formación de cLTM se mantuvo durante mucho tiempo sin decaer (Fig. 1f). Por lo tanto, cLTM se forma dentro de los 3 minutos posteriores al entrenamiento, lo que sugiere que no se requiere consolidación de la síntesis de proteínas para su formación.

Esta sorprendente observación nos llevó a investigar si cLTM es diferente de LTM tradicional o simplemente constituye el mismo memoria recuperada en diferentes contextos ambientales. Varias líneas de evidencia, presentadas a continuación, sugirieron que cLTM es un componente de memoria distinto con diferentes características moleculares y anatómicas.

Las neuronas dopaminérgicas están involucradas en la formación de cLTM

La formación de LTM requiere neuronas dopaminérgicas ( DAN), por lo que examinamos el papel de los DAN en la codificación cLTM, comparando la memoria de 24 h en las moscas de control con la de las moscas cuyas salidas sinápticas de los DAN se bloquearon durante el entrenamiento. Para este propósito, la expresión de UAS-Shibirets1 (Shits) se dirigió a DAN a través de TH-Gal4, de modo que se permitió la salida sináptica normal a temperaturas permisivas (23 ° C) pero bloqueada a temperaturas restrictivas (32 ° C) 36. Para garantizar condiciones ambientales consistentes entre el entrenamiento y las pruebas, adoptamos un régimen estricto para los tratamientos de temperatura. Específicamente, para bloquear la transmisión sináptica durante el entrenamiento, las moscas se movieron a un ambiente de 32 ° C 30 minutos antes del entrenamiento y de regreso a 23 ° C inmediatamente antes del entrenamiento. Luego completaron el entrenamiento en 5 minutos y se probaron 24 horas después a 23 ° C. Dentro de la ventana de tiempo dada (5 min), la transmisión sináptica de las neuronas que expresan Shits permaneció bloqueada (Fig. 2a complementaria). De manera similar, en el caso de los ensayos que requirieron bloqueo de neuronas durante la prueba, las moscas se trasladaron a un entorno de 32 ° C antes de la prueba, pero se entrenaron y probaron a 23 ° C (Fig. 2a). Los resultados mostraron que bloquear la liberación de neurotransmisores de neuronas marcadas con TH-Gal4 alteraba la formación de cLTM, lo que sugiere que se requieren DAN para la codificación de cLTM. Esta conclusión fue respaldada por el ensayo conductual, que mostró que no se produjo cLTM en las moscas mutantes del receptor de dopamina (dDA1) de Drosophila D1 (dDA1dumb2) 37 o en moscas con eliminación panneuronal de dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb -Gal4) (Figura 2b). Esto sugiere que la neuromodulación mediada por dDA1 juega un papel en la adquisición de cLTM.

Sin embargo, los dDA1 expresados en neuronas MB no participaron en la adquisición de cLTM, porque la sobreexpresión dirigida de dDA1 en neuronas MB en un fondo mutante dDA1dumb2 (dDA1dumb2; OK107-Gal4) no logró rescatar la adquisición de cLTM. De acuerdo con esto, la caída de dDA1 en neuronas MB (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) no afectó a cLTM. Estos datos sugieren que cLTM está codificado por neuromodulación mediada por dDA1, pero no en la MB.

La recuperación de cLTM es independiente de las neuronas del cuerpo del hongo

Curiosamente, las dDA1 en las neuronas MB fueron no involucrados en la adquisición de cLTM, mientras que todos los estudios previos en este campo han encontrado que la formación de componentes de memoria aversivos independientes del contexto, incluido el LTM tradicional, involucra neuronas MB38,39,40,41. Para confirmar esta observación, examinamos las funciones de las neuronas MB en la recuperación de cLTM. Con este fin, la expresión de UAS-Shits se dirigió a las neuronas MB a través de dos controladores Gal4 independientes: OK107-Gal4 y C772-Gal4 (Fig. Complementaria 2b, c). Aunque la recuperación de LTM falló en OK107-Gal4; UAS-Shits vuela (Fig.2d complementaria), cLTM permaneció intacto en OK107-Gal4; UAS-Shits y C772-Gal4; UAS-Shits vuela (Fig.2c, d), lo que confirma que Las neuronas MB no están involucradas en la formación o recuperación de cLTM.

La recuperación de cLTM requiere AL y neuronas de proyección

Para identificar qué regiones del cerebro son necesarias para la recuperación de cLTM, investigamos el papel de AL neuronas locales y neuronas de proyección (NP). La información olfativa en las moscas se transmite desde las neuronas sensoriales a las neuronas AL y NP que luego se bifurcan hacia MB y LH42. Primero probamos los efectos de bloquear la salida sináptica de las neuronas locales AL marcadas por OK66-Gal4 (Fig. 3a complementaria). El bloqueo de la transmisión sináptica a temperaturas restrictivas abolió cLTM en OK66-Gal4; UAS-Shits vuela (Fig. 3a). Luego probamos los efectos de dos subgrupos distintos de neuronas de proyección, con neuronas de proyección excitadoras (ePN) que se proyectan tanto a la MB como a la LH, marcadas con GH146-Gal4 (Fig. 3b complementaria), y neuronas de proyección inhibidoras (iPN) que se proyectan solo a la región LH, marcada por MZ699-Gal4 (Fig. complementaria 3c). La mejora de la memoria de 24 h en presencia de cuadrículas no fue evidente cuando se bloqueó la salida de ePN o iPN (Fig. 3b, c). Estas observaciones demuestran que las neuronas AL y las NP participan en la transmisión de información olfativa durante la recuperación de cLTM, como ocurre con todos los componentes de memoria independientes del contexto previamente identificados. Por el contrario, los iPN etiquetados con MZ699-Gal4, que se proyectan a la LH, son necesarios para la habituación olfativa, pero no para la recuperación de la memoria independiente del contexto28,43. Este efecto de MZ699-Gal4 implica que la LH juega un papel en la recuperación de cLTM.

La recuperación de cLTM requiere neuronas LH y AMMC

Curiosamente, las neuronas LH están conectadas a múltiples regiones cerebrales remotas25. Un descubrimiento reciente informa que la LH recibe entradas multisensoriales de regiones cerebrales de varios sistemas sensoriales44. Estos incluyen el centro mecanosensorial y motor antenal (AMMC), que comunica información mecanosensorial, el protocerebro lateral ventral (vlpr), responsable de la visión del color33, y otras áreas involucradas en el gusto y la temperatura32,45.Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que tales conexiones neuronales convergentes median la recuperación de cLTM utilizando múltiples modalidades sensoriales.

Para probar esta hipótesis, primero nos enfocamos en un subgrupo de neuronas LH vinculadas a la AMMC. Este centro recibe diversas señales mecanosensoriales del órgano de Johnson, que incluyen el tacto, la audición, la propiocepción y la detección del viento46,47,48,49. Luego transmite estas señales a otras regiones del cerebro, incluida la LH25. El patrón de expresión de NP1004-Gal4 se visualizó mediante la tinción del marcador diana de membrana mCD8: GFP en NP1004-Gal4; UAS-mCD8: moscas GFP (Fig. 4a, panel izquierdo). De hecho, las neuronas AMMC-LH marcadas con NP1004-Gal4 y la inmunotinción mostraron que el marcador presináptico syt :: GFP (una fusión de eGFP y la proteína de vesícula sináptica sinaptotagmina) está enriquecido dentro de la LH de NP1004-Gal4; UAS-syt :: GFP vuela (Fig. 4a, panel derecho), lo que sugiere que hay conexiones sinápticas desde el AMMC al LH.

El bloqueo reversible de la transmisión sináptica inducido por choque térmico afectó la recuperación de cLTM en NP1004-Gal4; UAS-Shits vuela (Fig. 4b). Corroborando esta observación, el bloqueo de la transmisión sináptica en neuronas AMMC marcadas con R38E07-Gal4 y NP0761-Gal4 también suprimió la recuperación de cLTM (Fig. 4c y Fig. 4c complementaria). Estos resultados sugieren que la representación de la información mecanosensorial dentro de las neuronas AMMC-LH es fundamental para la recuperación de cLTM. Para confirmar aún más esta conclusión, bloqueamos las entradas mecanosensoriales mediante la eliminación de arista, que es un órgano mecanosensorial importante en Drosophila, después del entrenamiento. Los resultados mostraron que este tratamiento dañó cLTM (Fig. 4d) pero no tuvo ningún impacto en el aprendizaje (Fig. 4d complementaria), lo que sugiere un papel de las neuronas AMMC-LH en cLTM.

A continuación, obtuvimos imágenes de las respuestas de calcio en el terminal LH de las neuronas AMMC-LH después de un estímulo mecanosensorial aplicado con un pincel pequeño al arista (ver la sección de Métodos). Con este fin, expresamos GCamP6f, una proteína fluorescente sensible al calcio50, impulsada por NP1004-Gal4. Luego registramos la fluorescencia de GCamP6f de las regiones LH (Fig. 4e). Hubo respuestas sólidas al contacto del arista con el cepillo en la región de la LH, lo que respalda la noción de que la información mecanosensorial se transmite a la LH a través de las neuronas AMMC-LH.

Para confirmar que estas observaciones eran significativas desde el punto de vista del comportamiento, monitoreamos Actividad neuronal AMMC utilizando el reportero transcripcional de calcio intracelular (TRIC) 51, que aumenta la expresión de GFP en proporción a los niveles de calcio intracelular en moscas. La fluorescencia de TRIC de la región AMMC se calculó 3 h después de la recuperación y se normalizó para controlar las moscas (Fig. 4f). Se observó una señal TRIC significativamente mayor en el AMMC después de la recuperación dependiente del contexto que en las moscas de control o después de la recuperación independiente del contexto, lo que demuestra que la actividad neuronal AMMC se correlaciona bien con la recuperación dependiente del contexto. Por tanto, las neuronas LH son capaces de integrar información mecanosensorial de AMMC e información olfativa de AL para recuperar cLTM (Fig. 4g).

La integración multisensorial en la LH subyace en la recuperación de cLTM

Luego verificamos si otros sistemas sensoriales también estaban involucrados en este proceso, como el sistema visual. Bloqueamos la entrada visual a través de la expresión dirigida de Mierdas mutantes sensibles a la temperatura en los ojos (UAS-Shits; GMR-Gal4) y las neuronas del lóbulo óptico (UAS-Shits; R82D10-Gal4) durante la recuperación de cLTM (Figura complementaria 6a). cLTM fueron abolidos en ambos casos, lo que sugiere que el sistema visual también está involucrado en la recuperación de cLTM.

Dicha información visual, así como otras entradas sensoriales potenciales, supuestamente convergen a las neuronas LH, al igual que en el caso de las neuronas mecanosensoriales. aporte. Realizamos la expresión dirigida del marcador presináptico syt :: GFP en las líneas Gal4 disponibles, marcando las siguientes neuronas de LH, protocerebrum medial superior a LH (smpr-LH; MZ671-Gal4), protocerebrum lateral superior (relevante al gusto52) a LH (slpr -LH; NP3060-Gal4), y protocerebro medial lateral ventral (relevante para visual33) a LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. Los resultados mostraron que las proyecciones de las regiones cerebrales específicas se congregan, o hacen sinapsis, en la región LH (Fig. 5a), lo que sugiere que la información contextual diversa se transmite al LH.

Luego probamos los efectos de manipular las neuronas etiquetadas en la recuperación de cLTM. El bloqueo de la transmisión sináptica de cada subgrupo de neuronas de LH abolió la recuperación de cLTM (Fig. 5b y Fig. 5 complementaria). Sin embargo, la recuperación de cLTM no se vio afectada por el bloqueo de las neuronas de salida de MB (MB-V2, etiquetadas por NP2492-Gal4) que se proyectan a la LH, que se informó que era necesaria para LTM53 tradicional. Esta conexión puede ser necesaria para la recuperación de la memoria olfativa aversiva independiente del contexto53,54. Por lo tanto, la recuperación de cLTM también implica la integración de entradas sinápticas de otras regiones cerebrales sensoriales distintas a la LH (Fig. 5c).

Para determinar si estas neuronas de LH también están involucradas en la recuperación de la LTM tradicional, bloqueamos estas neuronas durante la recuperación después de un entrenamiento espaciado. Tal bloqueo no ejerció ningún impacto sobre LTM (Fig. 5b complementaria).

Para validar aún más el papel de las neuronas LH en la recuperación de cLTM, probamos los efectos del bloqueo de las neuronas de salida de LH. Se identifican varias cepas de Gal4 para marcar las neuronas de salida de LH44. El cLTM de 24 h no fue evidente cuando se bloqueó la salida de las neuronas marcadas por PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 o AV6b1 (figura complementaria 5c), mientras que AD1e1 y AV6a1 no lo fueron. Estas observaciones demuestran que LH juega un papel central en la recuperación de cLTM.

Tomando los datos presentados junto con el estudio informado de los componentes de memoria independientes del contexto, nos vemos llevados a proponer un modelo para la recuperación de cLTM y LTM (Fig. .6). La integración multisensorial en la LH permite la recuperación de cLTM, mientras que el olor condicionado por sí solo es suficiente en la recuperación de recuerdos independientes del contexto.