Palauttamalla kupariristikko koeputkeen paljastuu cLTM

Kaikki aiemmat julkaisut joissa käytetään averssiivista hajuaistoa Drosophilassa, ovat käyttäneet käyttäytymismäärityslaitteita ja menettelyjä, jotka on johdettu samasta suunnitteluperiaatteesta10. Eli kärpäset koulutetaan harjoitteluputkessa, jossa on kupariristikkopinta ja joka tuottaa sähköiskuja (kuva 1a, vasen paneeli) ja testataan koeputkissa, joissa ei ole kupariristikkoa (kuva 1a, keskipaneeli). Siten missään aikaisemmassa tutkimuksessa ei ole tarvittu averssiivisten muistikomponenttien hakemista kupariverkon läsnäoloa. Kun kupariristikko palautettiin koeputkiin (kuva 1a, oikea paneeli) – menettely, joka ei vaikuta hajun terävyyteen (täydentävä taulukko 1) tai johtaa väärään muistin suorituskykyyn (lisäkuva 1a), käyttäytymismääritys paljasti silmiinpistäviä vaikutuksia. Yhden kokeen vakauttaminen tuotti kupariverkosta riippuvan muistikomponentin, joka kesti kauemmin kuin aiemmin nähtiin, jopa toistuvissa toistuvissa kokeissa. Erityisesti muisti kesti vähintään 14 päivää, mikä oli pisin testattu jakso (kuva 1b).

Sen selvittämiseksi, vastaako tämä kupariverkkoon perustuva muistinparannus kontekstin palauttamisen yleisiä vaikutuksia, yritimme muuttaa harjoitusympäristön muita elementtejä, erityisesti ympäröivän valon väriä ja ympäristön lämpötilaa kärpinä pystyvät vastaamaan molempiin32,33. Kun punainen harjoitusvalo vaihdettiin keltaiseksi testauksessa tai päinvastoin, muistin paraneminen epäonnistui, vaikka kupariverkko olisi toimitettu (kuva 1c ja lisäkuva 1c). Vastaavasti parannus katosi, kun testauslämpötila oli selvästi erilainen kuin oppimislämpötila (23 ° C vs. 32 ° C, tai päinvastoin; kuva 1c ja täydentävä kuva 1d). Siksi koodauskontekstin minkä tahansa ympäristöolosuhteen muuttaminen esti kupariverkosta riippuvan muistin kokonaan.

Koodausympäristön ja testausympäristön välisen eron oli kuitenkin oltava riittävän merkittävä tai helposti havaittavissa, jotta se vaikuttaisi kupariverkosta riippuva muisti. Esimerkiksi muistinparannus säilyi, kun testauslämpötila muutettiin koodauslämpötilasta 23 ° C 25 ° C: n testauslämpötilaan (lisäkuva 1e).

Joka tapauksessa kuparin haku verkosta riippuva muisti vaatii ehdollisen hajun ja koodaavan ympäristökontekstin täydellisen palauttamisen. Siksi me kutsuimme tätä muistikomponenttia kontekstista riippuvaiseksi LTM: ksi (cLTM).

cLTM ei vaadi proteiinisynteesistä riippuvaa konsolidoitumista

Koska useimmat tutkimukset ovat saaneet aikaan LTM: n vain käyttämällä erillisiä harjoitusprotokollia ja koska LTM riippuu proteiinisynteesistä3, määritimme edelleen, onko proteiinisynteesistä riippuvainen konsolidointi tarpeen cLTM: lle.On huomattavaa, että tällaisen pitkäaikaisen muistin muodostuminen oli riippumatonta proteiinisynteesistä, koska proteiinisynteesin estäjän sykloheksimidin (CXM) antamisella ei ollut vaikutusta cLTM: n muodostumiseen (kuva 1d), kun taas sama hoito esti LTM: n muodostumisen (täydentävä kuva). 1f) odotetusti3,8,9. Tämän havainnon tueksi proteiinisynteesin estäminen RICIN34: n, eukaryoottisia ribosomeja inaktivoivan proteiinin, panneuronaalisella ilmentämisellä siirtogeenisissä kärpäsissä (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) ei myöskään vaikuttanut cLTM: n muodostumiseen (täydentävä kuva 1g). Vahvistimme tällaisen riippumattomuuden edelleen pan-hermosolujen ekspression kautta (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) cAMP-vaste-elementtiä sitovan proteiinin 2 (CREB2b) repressori-isoformista, jonka on raportoitu estävän LTM5: tä siirtogeenisissä kärpäsissä, ei ollut vaikutusta cLTM: ään ( Kuva 1g). Lisäksi klassiset oppimis- ja muistimutantit, rut1 ja rut2080, heikennetyllä cAMP-synteesillä, suorittivat normaalin cLTM: n (kuvio 1h). Esitetyt tiedot viittaavat siis voimakkaasti siihen, että cLTM: n muodostuminen ei vaadi proteiinisynteesiä ja on siksi erilainen kuin kontekstista riippumaton LTM. cLTM on myös erotettavissa anestesiaa kestävästä muistista (ARM), koska se pysyy normaalina retiisimutantissa (lisäkuva 1h), kun ARM on heikentynyt35.

Näiden yllättävien havaintojen vahvistamiseksi määritimme, muodostuiko cLTM vie aikaa, mikä on toinen osoitus konsolidoinnista. Tätä varten karakterisoimme cLTM: n vastustuskykyä kylmäsokkihoidolle, jonka tiedetään poistavan lyhyen ja keskipitkän ajan muistin3,8. 24 tuntia harjoittelun jälkeen tyypillinen kylmän sokkikäsittely ei vaikuttanut cLTM: ään (kuva 1d). Tällainen kylmäiskun kestävyys antoi meille mahdollisuuden suorittaa kaksi seurantakoketta:

Ensinnäkin käytimme kylmäiskuhoitoa 2 minuutin ajan välittömästi yhden hoitokokeen jälkeen. Kolmen minuutin lepäämisen jälkeen kylmäiskusta käyttäytymismääritys osoitti, että kylmäiskua kestävä cLTM oli jo muodostunut täydellä voimalla (noin 20% suoritustasosta); Toiseksi, havainnon vahvistamiseksi edelleen, pienennimme harjoittelun sähköiskun voimakkuutta 60: sta 20 V: een, jotta vältettäisiin muistin voimakkuuden vaikutukset kattoon. Huomasimme, että vaikka niin heikko harjoitteluvoima, cLTM muodostui välittömästi, koska samanlaisia parannuksia oli heti läsnä muistissa, mikä osoittaa, että cLTM: n muodostuminen jatkui pitkään ilman hajoamista (kuva 1f). Siten cLTM muodostuu 3 minuutin kuluessa harjoittelusta, mikä viittaa siihen, että sen muodostumiseen ei tarvita proteiini-synteesikonsolidoitumista.

Tämä yllättävä havainto sai meidät tutkimaan, eroako cLTM perinteisestä LTM: stä vai onko se vain sama muisti, joka on haettu erilaisista ympäristöyhteyksistä. Useat jäljempänä esitetyt todisteet viittasivat siihen, että cLTM on erillinen muistikomponentti, jolla on erilaiset molekyyli- ja anatomiset ominaisuudet. DAN: t), joten tutkimme DAN: ien roolia cLTM-koodauksessa vertaamalla 24 tunnin muistia ohjauskärpästen kanssa sellaisten kärpästen muistiin, joiden synaptiset lähdöt DAN: ista estettiin harjoittelun aikana. Tätä tarkoitusta varten UAS-Shibirets1: n (Shits) ilmentyminen kohdistettiin DAN: iin TH-Gal4: n kautta, joten normaali synaptinen ulostulo sallittiin sallivissa lämpötiloissa (23 ° C), mutta estettiin rajoittavissa lämpötiloissa (32 ° C) 36. Varmistaaksemme yhdenmukaiset ympäristöolosuhteet harjoittelun ja testauksen välillä, otimme käyttöön tiukan lämpötilahoidon. Erityisesti synaptisen leviämisen estämiseksi harjoituksen aikana kärpäset siirrettiin 32 ° C: n ympäristöön 30 minuuttia ennen harjoittelua ja takaisin 23 ° C: seen välittömästi ennen harjoittelua. Sitten he suorittivat koulutuksen 5 minuutissa ja testattiin 24 tuntia myöhemmin 23 ° C: ssa. Annetussa aikaikkunassa (5 min) passeja ilmentävien neuronien synaptinen siirto pysyi estettynä (lisäkuva 2a). Vastaavasti määrityksissä, jotka vaativat hermosolun estoa testauksen aikana, kärpäset siirrettiin 32 ° C: n ympäristöön ennen testausta, mutta koulutettiin ja testattiin 23 ° C: ssa (kuvio 2a). Tulokset osoittivat, että hermovälittäjäaineiden vapautumisen estäminen TH-Gal4-leimattuista hermosoluista heikensi cLTM: n muodostumista, mikä viittaa siihen, että DL: itä tarvitaan cLTM-koodaukseen. Tätä johtopäätöstä tukivat myös käyttäytymismääritykset, jotka osoittivat, ettei cLTM: tä esiintynyt Drosophila D1 -dopamiinireseptorin (dDA1) mutanttikärpäsissä (dDA1dumb2) 37 tai kärpäsissä, joissa dDA1: n (UAS-dDA1-RNAi; nSyb -Gal4) (kuva 2b). Tämä viittaa siihen, että dDA1-välitteisellä neuromodulaatiolla on rooli cLTM-hankinnassa.

MB-neuroneissa ilmaistut dDA1: t eivät kuitenkaan olleet mukana cLTM-hankinnassa, koska dDA1: n kohdennettu yliekspressio MB-neuroneissa dDA1dumb2-mutanttitaustalla (dDA1dumb2; OK107-Gal4) ei onnistunut pelastamaan cLTM-hankintaa. Tämän mukaisesti dDA1-pudotus MB-neuroneissa (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) ei vaikuttanut cLTM: ään. Nämä tiedot viittaavat siihen, että cLTM: ää koodaa dDA1-välitteinen neuromodulaatio, mutta ei MB: ssä.

cLTM: n haku on riippumatonta sienirungon neuroneista

Mielenkiintoista on, että MB-neuronien dDA1: t olivat ei ole mukana cLTM-hankinnassa, kun taas kaikki aikaisemmat tutkimukset tällä alalla ovat havainneet, että kontekstiriippumattomien, aversiivisten muistikomponenttien, mukaan lukien perinteinen LTM, muodostuminen sisältää MB-neuroneja Tämän havainnon vahvistamiseksi tutkimme MB-hermosolujen rooleja cLTM-haulla. Tätä varten UAS-Shits-ekspressio kohdennettiin MB-neuroneihin kahden itsenäisen Gal4-ohjaimen kautta: OK107-Gal4 ja C772-Gal4 (täydentävä kuva 2b, c). Vaikka LTM-haku epäonnistui OK107-Gal4: ssä; UAS-Shits-kärpäset (täydentävä kuva 2d), cLTM pysyi ehjänä OK107-Gal4: ssä; UAS-Shits ja C772-Gal4; UAS-Shits lentää (kuva 2c, d), mikä vahvistaa, että MB-neuronit eivät osallistu cLTM: n muodostumiseen tai hakemiseen.

cLTM: n noutaminen vaatii AL- ja projektio-neuroneja

Selvittämään mitä aivojen alueita tarvitaan cLTM-hakuun. AL paikalliset hermosolut ja projektio neuronit (PN). Kärpästen hajutiedot välitetään aistien hermosoluista AL-hermosoluihin ja PN: hin, jotka sitten haarautuvat MB: ksi ja LH42: ksi. Testasimme ensin OK66-Gal4: n (täydentävä kuva 3a) leimatun AL-paikallishermonien synaptisen ulostulon estämisen vaikutukset. Synaptisen lähetyksen esto rajoittavassa lämpötilassa poisti cLTM: n OK66-Gal4: ssä; UAS-Shits lentää (kuva 3a). Sitten testasimme kahden erillisen projektio-hermosolujen alaryhmän vaikutukset, kun sekä MB: lle että LH: lle ulkonevat eksitaatio-projektio-neuronit (ePN: t), jotka on merkitty GH146-Gal4: llä (lisäkuva 3b), ja estävät projektio-neuronit (iPN: t), jotka heijastavat vain LH-alue, merkitty MZ699-Gal4: llä (täydentävä kuva 3c). 24 tunnin muistinparannus verkkojen läsnä ollessa ei ollut ilmeistä, kun joko ePN: ien tai iPN: n lähtö estettiin (kuvat 3b, c). Nämä havainnot osoittavat, että AL-neuronit ja PN: t osallistuvat hajutiedonsiirtoon cLTM-haun aikana, kuten kaikkien aiemmin tunnistettujen kontekstista riippumattomien muistikomponenttien kohdalla. Sitä vastoin MZ699-Gal4: llä merkittyjä iPN: itä, jotka heijastuvat LH: lle, vaaditaan hajun tottumiseen, mutta ei kontekstiriippumattoman muistin noutamista28, 43. Tämä MZ699-Gal4: n vaikutus tarkoittaa, että LH: lla on rooli cLTM-haulla.

CLTM: n haku vaatii LH- ja AMMC-neuroneja

Mielenkiintoista on, että LH-neuronit ovat yhteydessä useisiin kaukaisiin aivojen alueisiin25. Äskettäinen löytö kertoo, että LH vastaanottaa moniaistisia tuloja eri aistijärjestelmien aivojen alueilta44. Näitä ovat antennimekanisensori ja moottorikeskus (AMMC), joka välittää mekanisensoriset tiedot, ventral lateral protocerebrum (vlpr), joka on vastuussa värinäköstä33, sekä muut makuun ja lämpötilaan liittyvät alueet32, 45.Oletimme siis, että tällaiset yhtenevät hermosoluyhteydet välittävät cLTM-haun useilla aistimoodaaleilla.

Tämän hypoteesin testaamiseksi keskityimme ensin AMMC: hen liitettyyn LH-neuronien alaryhmään. Tämä keskus vastaanottaa erilaisia mekanisensorisia signaaleja Johnsonin elimiltä, mukaan lukien kosketus, kuulo, proprioseptio ja tuulentunnistus46, 47, 48, 49. Sitten se välittää nämä signaalit muille aivojen alueille, mukaan lukien LH25. NP1004-Gal4: n ilmentymiskuvio visualisoitiin värjäämällä membraanikohderekisteri mCD8: GFP NP1004-Gal4: ssä; UAS-mCD8: GFP lentää (kuva 4a, vasen paneeli). Todellakin, NP1004-Gal4: llä leimatut AMMC-LH-neuronit ja immunovärjäys osoittivat, että presynaptinen markkeri syt :: GFP (eGFP: n ja synaptisen vesikkeliproteiinisynaptotagmiinin fuusio) on rikastettu NP1004-Gal4: n LH: n sisällä; UAS-syt :: GFP lentää (kuva 4a, oikea paneeli), mikä viittaa siihen, että AMMC: stä LH: hen on synaptisia yhteyksiä.

Lämpöiskun aiheuttama palautuva synaptisen lähetyksen esto heikensi cLTM-hakua NP1004-Gal4: ssä; UAS-Shits lentää (kuva 4b). Vahvistaen tämän havainnon, synaptisen lähetyksen esto AMMC-neuroneissa, jotka on merkitty R38E07-Gal4: llä ja NP0761-Gal4: llä, myös tukahdutti cLTM-haun (kuva 4c ja täydentävä kuva 4c). Nämä tulokset viittaavat siihen, että mekanisensorisen informaation esitys AMMC-LH-neuroneissa on kriittinen cLTM-haun kannalta. Tämän johtopäätöksen vahvistamiseksi estimme mekanisensoriset sisääntulot poistamalla harjoittelun jälkeen aristan, joka on Drosophilan tärkein mekanisensorinen elin. Tulokset osoittivat, että tämä hoito heikensi cLTM: ää (kuva 4d), mutta sillä ei ollut vaikutusta oppimiseen (täydentävä kuva 4d), mikä viittaa AMMC-LH-neuronien rooliin cLTM: ssä.

Seuraavaksi kuvasimme kalsiumvasteita AMMC-LH-hermosolujen LH-pääte mekanosensorisen ärsykkeen jälkeen, jota pienellä harjalla levitettiin aristalle (katso Menetelmät-osio). Tätä varten ilmaisimme GCamP6f: n, kalsiumherkän fluoresoivan proteiinin50, jota ohjaa NP1004-Gal4. Nauhoitimme sitten GCamP6f: n fluoresenssin LH-alueilta (kuvio 4e). Lista-alueella löydettiin vankat vastaukset aristakontaktista harjalla LH-alueella, mikä tukee käsitystä, että mekanisensoriset tiedot välitetään LH: lle AMMC-LH-neuronien kautta.

Vahvistamme näiden havaintojen olevan käyttäytymiseltä merkittäviä, seurasimme AMMC-hermosolujen aktiivisuus käyttämällä solunsisäisen kalsiumin (TRIC) 51 transkriptionaalista reportteria, joka lisää GFP-ilmentymistä suhteessa solujen sisäisiin kalsiumpitoisuuksiin kärpäsiä. TRIC: n fluoresenssi AMMC-alueelta laskettiin 3 tuntia haun jälkeen ja normalisoitiin kontrolliperhoiksi (kuvio 4f). Merkitsevästi suurempi TRIC-signaali havaittiin AMMC: ssä kontekstiriippuvan haun jälkeen kuin kontrollikärpäsissä tai kontekstista riippumattoman haun jälkeen, mikä osoittaa, että AMMC: n hermosolujen aktiivisuus korreloi hyvin kontekstista riippuvan haun kanssa. Siten LH-neuronit pystyvät integroimaan AMMC: n mekaanisen sensorin ja AL: n hajutiedot cLTM: n saamiseksi (kuvio 4g).

Moniaistinen integrointi LH: hen on cLTM-haun taustalla

Sitten tarkasimme edelleen, olivatko muut aistijärjestelmät mukana myös tässä prosessissa, kuten visuaalinen järjestelmä. Estimme visuaalisen sisääntulon kohdennetulla ilmentämisellä lämpötilaherkät mutanttisisäkkeet silmissä (UAS-Shits; GMR-Gal4) ja optisen lohkon neuronit (UAS-Shits; R82D10-Gal4) cLTM-haun aikana (täydentävä kuva 6a). cLTM kumottiin molemmissa tapauksissa, mikä viittaa siihen, että visuaalinen järjestelmä on mukana myös cLTM: n hakemisessa.

Tällainen visuaalinen tulo sekä muut potentiaaliset aistinvaraiset tulot oletettavasti konvergoituvat LH-neuroneihin, aivan kuten mekaanisen sensorin tapauksessa. tulo. Suoritimme presynaptisen markkerin syt :: GFP kohdennetun ilmentämisen käytettävissä olevissa Gal4-linjoissa, merkitsemällä seuraavat LH-neuronit, ylimmän mediaalisen protocerebrumin LH: lle (smpr-LH; MZ671-Gal4), ylemmän lateraalisen protocerebrumin (olennainen maun52 kannalta) LH: lle (slpr -LH; NP3060-Gal4) ja ventral lateral medial protocerebrum (relevantti visual33: lle) LH: lle (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. Tulokset osoittivat, että kohdistettujen aivojen alueiden ennusteet kokoontuvat tai muodostavat synapseja LH-alueelle (kuva 5a), mikä viittaa siihen, että monipuolinen asiayhteyteen liittyvä tieto välitetään LH: lle.

Testasimme sitten leimattujen hermosolujen manipuloinnin vaikutukset cLTM-hakuun. LH-neuronien jokaisen alaryhmän synaptisen siirron estäminen lopetti cLTM-haun (kuvio 5b ja täydentävä kuva 5). CLTM-noutoon ei kuitenkaan vaikuttanut LH: lle heijastuvien MB-lähtöhermosolujen (MB-V2, leimattu NP2492-Gal4) estäminen, minkä ilmoitettiin vaadittavan perinteiselle LTM53: lle. Tämä yhteys voi olla tarpeen kontekstiriippumattoman averssiivisen hajumuistin noutamiseksi 53,54. Siten cLTM-haku sisältää myös synaptisten syötteiden integroinnin muista erillisistä aistien aivojen alueista LH: een (kuva 5c).

Määritämme, ovatko nämä LH-neuronit mukana myös perinteisen LTM: n hakemisessa, estimme nämä neuronit haun jälkeen etäisyyden harjoittelun jälkeen. Tällainen saarto ei vaikuttanut LTM: ään (täydentävä kuva 5b).

LH-hermosolujen roolin vahvistamiseksi cLTM: n hakemisessa testasimme sitten LH-lähtöhermosolujen estämisen vaikutukset. LH-ulostulon neuronien leimaamiseksi tunnistetaan joukko Gal4-kantoja. 24 tunnin cLTM ei ollut ilmeinen, kun PV5b3: n, AD1d1: n, AV4b4 / c1: n, PV5g1 / g2: n tai AV6b1: n leimattujen neuronien ulostulo estettiin (lisäkuva 5c), kun taas AD1e1 ja AV6a1 eivät. Nämä havainnot osoittavat, että LH: lla on keskeinen rooli cLTM-haulla.

Kun otetaan huomioon esitetyt tiedot yhdessä kontekstiriippumattomien muistikomponenttien raportoidun tutkimuksen kanssa, meidät johdetaan ehdottamaan mallia cLTM- ja LTM-hakuihin (kuvio 6). Multisensorinen integrointi LH: n porttiin cLTM: n noudettavuus, kun taas ehdollinen haju riittää kontekstiriippumattomien muistien hakemiseen.