Återinförande av kopparnätet till provröret avslöjar cLTM

Alla tidigare publikationer som involverar aversiv olfaktorisk konditionering i Drosophila har använt beteendeanalysapparater och procedurer härledda från samma designprincip10. Det vill säga flugorna tränas i ett träningsrör med en kopparnätyta som levererar elektriska stötar (fig. 1a, vänster panel) och testas i provrör utan koppargallret (fig. 1a, mittpanelen). I inga tidigare studier har sålunda hämtningen av aversiva minneskomponenter krävt närvaron av kopparnätet. När kopparnätet återinstallerades i teströren (fig. 1a, högra panelen) – ett förfarande som inte påverkar luktstyrkan (kompletterande tabell 1) eller leder till falskt minne (kompletterande bild 1a), avslöjade beteendeanalysen slående effekter. Enprovningskonditionering producerade en kopparkomponentberoende minneskomponent som upprätthöll längre än de som tidigare sett, även i åtskilda, upprepade försök. Specifikt varade minnet i minst 14 dagar, vilket var den längsta testade perioden (fig 1b).

För att avgöra om den här koppargridberoende minnesförbättringen återspeglar de allmänna effekterna av återställning av sammanhang försökte vi ändra andra element i träningsmiljön, särskilt färgen på det omgivande ljuset och omgivningstemperaturen kan svara på båda 32,33. När det röda träningslampan byttes till gult vid testning, eller vice versa, kunde minnesförbättring inte ske, även om koppargalleriet tillhandahölls (fig 1c och kompletterande fig 1c). På samma sätt försvann förbättringen när testtemperaturen var markant annorlunda än inlärningstemperaturen (23 ° C mot 32 ° C, eller vice versa; Fig. 1c och kompletterande Fig. 1d). Därför blockerade det ändrade miljöförhållandet i kodningskontexten helt det koppar-beroende minnet.

Skillnaden mellan kodningsmiljön och testmiljön måste dock vara tillräckligt betydande eller lätt detekterbar för att påverka hämtningen av kopparnätberoende minne. Till exempel bevarades minnesförbättring när testtemperaturen ändrades från en kodande temperatur på 23 ° C till en testtemperatur på 25 ° C (kompletterande figur 1e).

I vilket fall som helst, hämtning av koppar nätberoende minne kräver konditionerad lukt och fullständig återställning av det kodande miljösammanhanget. Det är därför vi kallade denna minneskomponent som kontextberoende LTM (cLTM).

cLTM kräver ingen proteinsyntesberoende konsolidering

Eftersom de flesta studier endast har framkallat LTM med hjälp av åtskilda träningsprotokoll och eftersom LTM beror på proteinsyntes3 bestämde vi vidare om proteinsyntesberoende konsolidering är nödvändig för cLTM.Anmärkningsvärt var bildandet av ett sådant långvarigt minne oberoende av proteinsyntes, eftersom administrering av cykloheximid (CXM), en proteinsyntesinhibitor, inte hade någon inverkan på cLTM-bildning (fig 1d), medan samma behandling blockerade LTM-bildning (kompletterande . 1f), som förväntat3,8,9. Till stöd för denna observation visade hämning av proteinsyntes genom pan-neuronal expression av RICIN34, ett protein som inaktiverar eukaryota ribosomer, i transgena flugor (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) ingen effekt på cLTM-bildningen heller (kompletterande figur 1g). Vi bekräftade en sådan oberoende ytterligare genom pan-neuronal expression (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) av en repressorisoform av cAMP-respons-elementbindande protein 2 (CREB2b) som rapporteras blockera LTM5 i transgena flugor hade ingen inverkan på cLTM ( Fig. 1g). Dessutom utförde klassisk inlärning och minne rutabaga (rut) mutanter, rut1 och rut2080, med försvagad cAMP-syntes normal cLTM (fig. 1h). Således visar data som presenteras starkt att cLTM-bildning inte kräver någon proteinsyntes och därför skiljer sig från den kontextoberoende LTM. cLTM kan också särskiljas från anestesiresistent minne (ARM) för det förblir normalt i en rädisemutant (kompletterande figur 1h) medan ARM är nedsatt35.

För att validera dessa överraskande resultat bestämde vi om bildandet av cLTM tar tid, en annan indikation på konsolidering. För detta ändamål karakteriserade vi motståndet från cLTM mot kallchockbehandling, vilket är känt för att avskaffa korttids- och medellångt minne3,8. Tjugofyra timmar efter träning förblev cLTM opåverkad (figur 1d) av typisk kallchockbehandling. Sådan kallchockresistens tillät oss att utföra två uppföljningsexperiment:

För det första applicerade vi kallchockbehandling i 2 minuter omedelbart efter en konditioneringsstudie. Efter 3 minuters vila från kylchocken visade en beteendeanalys att den kallchockresistenta cLTM redan bildades i full styrka (cirka 20% av det utförande indexet; Fig 1e). För det andra, för att ytterligare validera observationen, minskade vi styrkan på träningselektriskchocken från 60 till 20 V för att undvika takeffekter av minnesstyrka. Vi fann att även vid en så svag träningsstyrka bildades cLTM omedelbart, eftersom liknande förbättringar omedelbart fanns i minnet, vilket indikerar att cLTM-bildning som upprätthölls länge utan att sönderfalla (fig 1f). Således bildas cLTM inom 3 minuter efter träning, vilket tyder på att ingen proteinsynteskonsolidering krävs för dess bildning.

Denna överraskande observation fick oss att undersöka om cLTM skiljer sig från traditionell LTM eller bara utgör samma minne som hämtats i olika miljösammanhang. Flera bevisrader, presenterade nedan, föreslog att cLTM är en distinkt minneskomponent med olika molekylära och anatomiska egenskaper.

Dopaminerga neuroner är involverade i cLTM-bildning

LTM-bildning kräver dopaminerga neuroner ( DAN: er), så vi undersökte rollen som DAN: er i cLTM-kodning och jämförde 24-timmarsminne i kontrollflugor med flugor vars synaptiska utdata från DAN blockerades under träning. För detta ändamål riktades uttryck för UAS-Shibirets1 (Shits) till DAN genom TH-Gal4, så att normal synaptisk utmatning tillåts vid tillåtna temperaturer (23 ° C) men blockerades vid restriktiva temperaturer (32 ° C) 36. För att säkerställa enhetliga miljöförhållanden mellan träning och testning antog vi en strikt regim för temperaturbehandlingar. Specifikt, för att blockera synaptisk överföring under träning flyttades flugor in i en 32 ° C miljö 30 minuter före träning och tillbaka till 23 ° C omedelbart före träning. De avslutade sedan träningen inom 5 minuter och testades 24 timmar senare vid 23 ° C. Inom det angivna tidsfönstret (5 min) förblev synaptisk överföring av neuroner som uttrycker skits blockerad (kompletterande figur 2a). På samma sätt, när det gäller analyser som krävde neuronblockad under testning, flyttades flugor till en 32 ° C-miljö före testning men utbildades och testades vid 23 ° C (Fig. 2a). Resultaten visade att blockering av frisättningen av neurotransmittorn från TH-Gal4-märkta neuroner försämrade cLTM-bildningen, vilket tyder på att DAN krävs för cLTM-kodning. Denna slutsats stöddes ytterligare av beteendeanalysen, som visade att ingen cLTM inträffade i Drosophila D1 dopaminreceptorn (dDA1) -mutanta flugor (dDA1dumb2) 37 eller i flugor med pan-neuronal nedslagning av dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb -Gal4) (fig. 2b). Detta antyder att dDA1-medierad neuromodulation spelar en roll i cLTM-förvärv.

DDA1s som uttrycktes i MB-neuroner var emellertid inte inblandade i cLTM-förvärv, eftersom målinriktat överuttryck av dDA1 i MB-neuroner på en dDA1dumb2-mutantbakgrund (dDA1dumb2; OK107-Gal4) misslyckades med att rädda cLTM-förvärv. I överensstämmelse med detta påverkade dDA1-nedslagning i MB-nervceller (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) inte cLTM. Dessa data tyder på att cLTM kodas av dDA1-medierad neuromodulation, men inte i MB.

Hämtning av cLTM är oberoende av svampkroppsneuroner

Intressant är att dDA1 i MB-neuroner var inte involverad i cLTM-förvärv, medan alla tidigare studier inom detta område har funnit att bildning av kontextoberoende, aversiva minneskomponenter, inklusive traditionell LTM, involverar MB-neuroner38,39,40,41. För att bekräfta denna observation undersökte vi rollerna för MB-neuroner vid hämtning av cLTM. För detta ändamål riktades uttryck för UAS-Shits till MB-neuroner genom två oberoende Gal4-drivrutiner: OK107-Gal4 och C772-Gal4 (kompletterande figur 2b, c). Även om LTM-hämtning misslyckades i OK107-Gal4; UAS-Shits flugor (kompletterande figur 2d), förblev cLTM intakt i OK107-Gal4; UAS-Shits och C772-Gal4; UAS-Shits flugor (Bild 2c, d), vilket bekräftar att MB-neuroner är inte inblandade i bildandet eller hämtningen av cLTM.

Hämtning av cLTM kräver AL- och projektionsneuroner

För att identifiera vilka hjärnregioner som krävs för cLTM-hämtning undersökte vi rollen som AL-lokala nervceller och projektionsneuroner (PN). Olfaktorisk information i flugor vidarebefordras från sensoriska nervceller till AL-nervceller och PN som sedan förgrenas till MB och LH42. Vi testade först effekterna av att blockera den synaptiska produktionen från AL-lokala nervceller märkta av OK66-Gal4 (kompletterande figur 3a). Blockad av synaptisk överföring vid restriktiv temperatur avskaffade cLTM i OK66-Gal4; UAS-Shits flugor (fig. 3a). Vi testade sedan effekterna av två distinkta undergrupper av projektionsneuroner, med exciterande projektionsneuroner (ePN) som projicerar till både MB och LH, märkta av GH146-Gal4 (kompletterande figur 3b) och hämmande projektionsneuroner (iPNs) som endast projicerar LH-regionen, märkt av MZ699-Gal4 (kompletterande figur 3c). 24-timmarsförbättringen i närvaro av nät var inte uppenbar när utmatningen från varken ePN eller iPNs blockerades (fig. 3b, c). Dessa observationer visar att AL-nervceller och PN: er deltar i olfaktorisk informationsöverföring under hämtning av cLTM, som med alla tidigare identifierade kontextoberoende minneskomponenter. Däremot krävs iPNs märkta med MZ699-Gal4, som projicerar till LH, för olfaktorisk tillvänjning, men inte hämtning av kontextoberoende minne28,43. Denna effekt av MZ699-Gal4 innebär att LH spelar en roll i cLTM-hämtning.

Hämtning av cLTM kräver LH- och AMMC-neuroner

Intressant är att LH-neuroner är anslutna till flera avlägsna hjärnregioner25. En nyligen upptäckt rapporterar att LH tar emot multisensoriska ingångar från hjärnregioner i olika sensoriska system44. Dessa inkluderar antennmekanosensoriskt och motoriskt centrum (AMMC), som kommunicerar mekanosensorisk information, det ventrala laterala protocerebrumet (vlpr), som ansvarar för färgvision33, och andra områden som är involverade i smak och temperatur32,45.Vi antog således att sådana konvergerande neuronala anslutningar förmedlar cLTM-hämtning med flera sensoriska modaliteter.

För att testa denna hypotes fokuserade vi först på en undergrupp av LH-neuroner kopplade till AMMC. Detta centrum tar emot olika mekanosensoriska signaler från Johnsons organ, inklusive beröring, hörsel, proprioception och vindavkänning46,47,48,49. Den vidarebefordrar sedan dessa signaler till andra hjärnregioner, inklusive LH25. Uttrycksmönstret för NP1004-Gal4 visualiserades genom färgning av membranmålmarkören mCD8: GFP i NP1004-Gal4; UAS-mCD8: GFP flyger (bild 4a, vänster panel). AMMC-LH-neuroner märkta av NP1004-Gal4 och immunfärgning visade faktiskt att det presynaptiska markörsystemet :: GFP (en fusion av eGFP och det synaptiska vesikelproteinet synaptotagmin) är anrikat inom LH för NP1004-Gal4; UAS-syt :: GFP flyger (fig. 4a, högra panelen), vilket tyder på att det finns synaptiska anslutningar från AMMC till LH.

Värmechockinducerad reversibel blockad av synaptisk transmission försämrad cLTM-hämtning i NP1004-Gal4; UAS-Shits flyger (fig. 4b). För att bekräfta denna observation undertryckte blockad av synaptisk överföring i AMMC-neuroner märkta med R38E07-Gal4 och NP0761-Gal4 också cLTM-hämtning (Fig. 4c och kompletterande Fig. 4c). Dessa resultat tyder på att representationen av mekanosensorisk information inom AMMC-LH-neuroner är kritisk för cLTM-hämtning. För att ytterligare bekräfta denna slutsats blockerade vi mekanosensoriska ingångar genom att ta bort arista, som är ett stort mekaniskt sensoriskt organ i Drosophila, efter träning. Resultaten visade att denna behandling försämrade cLTM (Fig. 4d) men inte hade någon inverkan på inlärningen (Kompletterande Fig. 4d), vilket tyder på en roll för AMMC-LH-neuroner i cLTM.

Därefter avbildade vi kalciumsvar i LH-terminalen av AMMC-LH-neuroner efter mekanosensorisk stimulans applicerad med en liten borste på arista (se avsnittet Metoder). För detta ändamål uttryckte vi GCamP6f, ett kalciumkänsligt fluorescerande protein50, driven av NP1004-Gal4. Vi registrerade sedan fluorescensen av GCamP6f från LH-regionerna (fig. 4e). Det fanns robusta svar på arista-kontakt med borsten i LH-regionen, vilket stödde uppfattningen att mekanosensorisk information vidarebefordras till LH genom AMMC-LH-neuroner.

För att bekräfta att dessa observationer var beteendemässigt signifikanta övervakade vi AMMC neuronal aktivitet med hjälp av transkriptionsreporter av intracellulärt kalcium (TRIC) 51, vilket ökar GFP-expression i proportion till intracellulära kalciumnivåer i flugor. Fluorescensen av TRIC från AMMC-regionen beräknades 3 timmar efter hämtning och normaliserades för att kontrollera flugor (fig. 4f). Signifikant större TRIC-signal observerades i AMMC efter kontextberoende hämtning än i kontrollflugorna eller efter kontextoberoende hämtning, vilket visar att AMMC neuronal aktivitet korrelerar bra med kontextberoende hämtning. Således kan LH-neuroner integrera mekanosensorisk information från AMMC och luktinformation från AL för att hämta cLTM (fig. 4g).

Multisensorisk integration i LH ligger bakom cLTM-hämtning

Vi verifierade sedan om andra sensoriska system också var inblandade i denna process, såsom det visuella systemet. Vi blockerade visuell inmatning genom målinriktat uttryck av temperaturkänsliga mutantskits i ögonen (UAS-Shits; GMR-Gal4) och de optiska lobneuronerna (UAS-Shits; R82D10-Gal4) under hämtning av cLTM (kompletterande figur 6a). cLTM avskaffades i båda fallen, vilket tyder på att det visuella systemet också är involverat i hämtningen av cLTM.

Sådan visuell ingång liksom andra potentiella sensoriska ingångar förmodligen konvergerar till LH-neuroner, precis som i fallet med mekanosensorisk inmatning. Vi utförde målinriktat uttryck av det presynaptiska markörsystemet :: GFP i tillgängliga Gal4-linjer, märkning av följande LH-neuroner, överlägsen medial protocerebrum till LH (smpr-LH; MZ671-Gal4), överlägsen lateral protocerebrum (relevant för smak52) till LH (slpr -LH; NP3060-Gal4) och ventralt lateralt medialt protocerebrum (relevant för visual33) till LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. Resultaten visade att projektioner från riktade hjärnregioner samlas, eller gör synapser, i LH-regionen (Fig. 5a), vilket tyder på att olika kontextuell information vidarebefordras till LH.

Vi testade sedan effekterna av att manipulera de märkta nervcellerna på hämtning av cLTM. Blockering av synaptisk överföring av varje undergrupp av LH-neuroner avskaffade cLTM-hämtning (fig. 5b och kompletterande fig. 5). Emellertid påverkades inte cLTM-hämtning av blockad av MB-utmatningsneuroner (MB-V2, märkt av NP2492-Gal4) som projekterade till LH, vilket rapporterades krävs för traditionell LTM53. Denna anslutning kan vara nödvändig för att hämta kontextoberoende aversivt olfaktoriskt minne53,54. Således involverar cLTM-hämtning också integration av synaptiska ingångar från andra distinkta sensoriska hjärnregioner till LH (fig. 5c).

För att avgöra om dessa LH-neuroner också är inblandade i hämtning av den traditionella LTM, blockerade vi dessa nervceller under hämtning efter träning på avstånd. Sådan blockad hade ingen inverkan på LTM (kompletterande fig. 5b).

För att ytterligare validera en roll av LH-neuroner vid hämtning av cLTM testade vi sedan effekterna av att blockera LH-neuroner. Ett antal Gal4-stammar identifieras för att märka LH-utmatningsneuroner44. 24-timmars cLTM var inte uppenbart när produktionen från neuroner märkta av PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 eller AV6b1 blockerades (kompletterande figur 5c), medan AD1e1 och AV6a1 inte var det. Dessa iakttagelser visar att LH spelar en central roll i cLTM-hämtning.

Om vi tar de data som presenteras tillsammans med den rapporterade studien av kontextoberoende minneskomponenter, leder vi till att föreslå en modell för cLTM- och LTM-hämtning (Fig 6). Multisensorisk integration i LH-grindarna hämtningsbarheten av cLTM medan konditionerad lukt ensam är tillräcklig för att hämta kontextoberoende minnen.