A rézrács visszaállításakor a kémcsőbe a cLTM

Minden korábbi publikáció aversív szaglás-kondicionálás Drosophilában, viselkedési-vizsgálati készülékeket és eljárásokat használtak ugyanazon tervezési elv alapján10. Vagyis a legyeket egy réz rácsfelülettel ellátott edzőcsőben képezzük ki, amely elektromos áramütést vált ki (1a. Ábra, bal oldali panel), és teszteljük a rézrács nélküli tesztcsövekben (1a. Ábra, középső panel). Így egyetlen korábbi tanulmányban sem volt szükség rádiórács jelenlétére az averzív memóriaelemek visszakereséséhez. Amikor a rézrácsot visszahelyezték a kémcsövekbe (1a. Ábra, jobb oldali panel) – ez egy olyan eljárás, amely nem befolyásolja a szagélességet (Kiegészítő 1. táblázat), vagy hamis memória teljesítményhez vezet (Kiegészítő 1a. Ábra), a viselkedési vizsgálat feltárta feltűnő hatások. Az egypróbás kondicionálás rézhálótól függő memóriakomponentust eredményezett, amely hosszabb ideig tartott, mint korábban láttuk, még szétválasztott, ismételt kísérletek során is. Pontosabban, a memória legalább 14 napig tartott, ez volt a leghosszabb tesztelt periódus (1b. Ábra).

képesek reagálni mindkettőre32,33. Amikor a piros edzőfényt sárga színre kapcsolta a tesztelés során, vagy fordítva, a memória javulása nem történt meg, még akkor sem, ha a rézrácsot biztosították (1c. Ábra és 1c. Kiegészítő ábra). Hasonlóképpen eltűnt a fokozás, amikor a teszt hőmérséklete jelentősen eltért a tanulási hőmérséklettől (23 ° C vs. 32 ° C, vagy fordítva; 1c. Ábra és 1d. Kiegészítő ábra). Ezért a kódolási környezet bármely környezeti állapotának megváltoztatása teljesen blokkolta a rézhálótól függő memóriát.

A kódoló környezet és a tesztelési környezet közötti különbségnek azonban kellően jelentősnek vagy könnyen észlelhetőnek kellett lennie ahhoz, hogy befolyásolja a a rézhálótól függő memória. Például a memória javítása megmaradt, amikor a teszt hőmérsékletét 23 ° C kódolási hőmérsékletről 25 ° C teszt hőmérsékletre változtatták (Kiegészítő 1e. Ábra).

Mindenesetre a réz visszanyerése a rácsfüggő memória feltételezett szagot és a kódoló környezeti kontextus teljes visszaállítását igényli. Ezért neveztük ezt a memóriakomponenset kontextustól függő LTM-nek (cLTM).

cLTM nem igényel fehérjeszintézistől függő konszolidációt

Mivel a legtöbb tanulmány csak LTM-et váltott ki távközönként elhelyezett edzésprotokollok segítségével , és mivel az LTM függ a fehérjeszintézistől3, tovább meghatároztuk, hogy szükséges-e a fehérjeszintézistől függő konszolidáció a cLTM-hez.Figyelemre méltó, hogy az ilyen hosszan tartó memória kialakulása független volt a fehérjeszintézistől, mivel a fehérjeszintézis inhibitor, a cikloheximid (CXM) beadása nem volt hatással a cLTM képződésére (1d. Ábra), míg ugyanez a kezelés blokkolta az LTM képződését (Kiegészítő ábra). (1f), a várakozásoknak megfelelően3,8,9. Ennek a megfigyelésnek az alátámasztására a fehérjeszintézis gátlása az eukarióta riboszómákat inaktiváló fehérje, a RICIN34 pánneuronális expressziójával transzgén legyekben (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) sem mutatott semmilyen hatást a cLTM képződésére (1g. Kiegészítő ábra). Ezt a függetlenséget tovább erősítettük a cAMP-válasz elemhez kötődő 2-es fehérje (CREB2b) represszor izoformájának pánneuronális expressziójával (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4), amelyről azt állítják, hogy transzgén legyekben blokkolja az LTM5-et. 1g. Ábra). Sőt, a klasszikus tanulási és memória rutabaga (rut) mutánsok, a rut1 és a rut2080, gyengített cAMP szintézissel, normál cLTM-et hajtottak végre (1h ábra). Így a bemutatott adatok határozottan arra utalnak, hogy a cLTM képződése nem igényel fehérjeszintézist, ezért eltér a kontextustól független LTM-től. A cLTM megkülönböztethető az anesztézia-rezisztens memóriától (ARM) is, mivel normál marad egy retek mutánsban (Kiegészítő 1h ábra), miközben az ARM károsodott35.

Ezen meglepő eredmények igazolásához megállapítottuk, hogy A cLTM időbe telik, ami a konszolidáció másik jele. Ennek érdekében jellemeztük a cLTM ellenállását a hideg-sokkos kezeléssel szemben, amelyről ismert, hogy megszünteti a rövid és a középtávú memóriát3,8. Huszonnégy órával az edzés után a tipikus hideg-sokkos kezelés nem befolyásolta a cLTM-et (1d. Ábra). Az ilyen hidegsokk-rezisztencia lehetővé tette számunkra, hogy két utókísérletet hajtsunk végre:

Először is, egy kondicionáló vizsgálat után 2 percig hideg-sokkos kezelést alkalmaztunk. A hideg sokktól számított 3 perc pihenés után egy viselkedési vizsgálat azt mutatta, hogy a hideg-sokknak ellenálló cLTM már teljes szilárdságban kialakult (a teljesítő index mintegy 20% -a; 1e. Ábra). Másodszor, a megfigyelés további érvényesítése érdekében az edzés elektromos sokkjának erejét 60-ról 20 V-ra csökkentettük, hogy elkerüljük a memória erejének bármilyen felső hatást. Megállapítottuk, hogy még ilyen gyenge edzési erő mellett is azonnal létrejött a cLTM, mert hasonló javítások azonnal jelen voltak a memóriában, jelezve azt a cLTM képződést, amely sokáig fennmaradt bomlás nélkül (1f. Ábra). Így a cLTM az edzés után 3 percen belül kialakul, ami azt sugallja, hogy a fehérje-szintézis konszolidációra nincs szükség a képződéséhez.

Ez a meglepő megfigyelés arra késztetett bennünket, hogy megvizsgáljuk, vajon a cLTM különbözik-e a hagyományos LTM-től, vagy csak ugyanazt jelenti-e. a különböző környezeti összefüggésekben beolvasott memória. Az alábbiakban bemutatott többféle bizonyíték arra utal, hogy a cLTM egy különálló memóriakomponens, különböző molekuláris és anatómiai jellemzőkkel.

A dopaminerg idegsejtek részt vesznek a cLTM kialakulásában

Az LTM kialakulásához dopaminerg neuronok szükségesek ( DAN-ok), ezért megvizsgáltuk a DAN-ok szerepét a cLTM-kódolásban, összehasonlítva a 24 órás memóriát a vezérlőlégyekben és azokban a legyekben, amelyeknél a DAN-ok szinaptikus kimenetei blokkolva voltak az edzés során. Erre a célra az UAS-Shibirets1 (szarok) expressziója a DAN-okra irányult a TH-Gal4-en keresztül, így a normál szinaptikus kimenet megengedett hőmérsékleten (23 ° C) megengedett volt, de korlátozó hőmérsékleten (32 ° C) 36 blokkolva volt. Az edzés és a tesztelés közötti következetes környezeti feltételek biztosítása érdekében szigorú rendszert fogadtunk el a hőmérsékleti kezelésekre. Pontosabban, az edzés közbeni szinaptikus átvitel blokkolásához a legyeket 30 perccel edzés előtt 32 ° C-os környezetbe, közvetlenül az edzés előtt pedig 23 ° C-ra helyeztük. Ezután 5 percen belül elvégezték az edzést, és 24 órával később 23 ° C-on tesztelték őket. A megadott időablakon belül (5 perc) a Shittet expresszáló neuronok szinaptikus átvitelét blokkolták (Kiegészítő 2a. Ábra). Hasonlóképpen, azoknál a vizsgálatoknál, amelyeknél a vizsgálat során idegsejt blokkolásra volt szükség, a legyeket a tesztelés előtt 32 ° C-os környezetbe helyezték, de 23 ° C-on képezték és tesztelték (2a. Ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a neurotranszmitter felszabadulásának blokkolása a TH-Gal4-jelölt idegsejtekből rontotta a cLTM képződést, ami arra utal, hogy DAN-okra van szükség a cLTM kódolásához. Ezt a következtetést támasztotta alá még a viselkedési vizsgálat is, amely azt mutatta, hogy a Drosophila D1 dopamin receptor (dDA1) mutáns legyek (dDA1dumb2) 37 vagy a dDA1 pánneuronális leütésével járó legyeknél (UAS-dDA1-RNAi; nSyb) nem történt cLTM. -Gal4) (2b. Ábra). Ez arra utal, hogy a dDA1 által közvetített neuromoduláció szerepet játszik a cLTM megszerzésében.

Az MB neuronokban kifejezett dDA1-ek azonban nem vettek részt a cLTM megszerzésében, mivel a dDA1 célzott túlzott expressziója MB neuronokban egy dDA1dumb2 mutáns háttéren (dDA1dumb2; OK107-Gal4) nem tudta megmenteni a cLTM megszerzését. Ezzel összhangban az MB neuronok dDA1 leütése (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) nem befolyásolta a cLTM-t. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a cLTM-et a dDA1 által közvetített neuromoduláció kódolja, az MB-ban azonban nem.

A cLTM visszakeresése független a gomba testének neuronjaitól

Érdekes módon az MB neuronokban lévő dDA1-ek nem vesz részt a cLTM elsajátításában, míg ezen a területen minden korábbi tanulmány megállapította, hogy a kontextustól független, averzív memóriakomponensek, köztük a hagyományos LTM kialakulása MB neuronokat foglal magában38,39,40,41. Ennek a megfigyelésnek a megerősítéséhez megvizsgáltuk az MB neuronok szerepét a cLTM visszakeresés során. Ebből a célból az UAS-Shits expresszióját két független Gal4-meghajtó: az OK107-Gal4 és a C772-Gal4 útján célozták meg az MB neuronok számára (2b. Ábra, c) Bár az LTM visszakeresése sikertelen volt az OK107-Gal4; UAS-Shits legyeknél (Kiegészítő 2d. Ábra), a cLTM sértetlen maradt OK107-Gal4; UAS-Shits és C772-Gal4; UAS-Shits repül (2c. Ábra, d). Az MB idegsejtjei nem vesznek részt a cLTM kialakításában vagy visszakeresésében.

A cLTM visszaszerzéséhez AL- és vetületi idegsejtekre van szükség

A cLTM-visszakereséshez szükséges agyi régiók azonosításához megvizsgáltuk AL lokális idegsejtek és vetületi idegsejtek (PN). A legyek szaglási információit az érzékelő idegsejtekről az AL idegsejtekre és a PN-kre továbbítják, amelyek ezután kettéágaznak az MB-ba és az LH42-be. Először teszteltük az OK66-Gal4 által jelölt AL helyi idegsejtek szinaptikus kimenetének blokkolásának hatásait (kiegészítő 3a. Ábra). A szinaptikus átvitel blokkolása korlátozó hőmérsékleten megszüntette a cLTM-et az OK66-Gal4-ben; UAS-szar repül (3a. Ábra). Ezután teszteltük a vetítőneuronok két különálló alcsoportjának hatását, mind az MB-ra, mind az LH-ra vetülő gerjesztő projekciós neuronokkal (ePN-ek), amelyeket a GH146-Gal4 (kiegészítő ábra 3b.) Jelöl, és a gátló projekciós neuronokat (iPN-ek), amelyek csak a az LH régió, amelyet az MZ699-Gal4 jelöl (3c. kiegészítő ábra). A 24 órás memóriajavítás rácsok jelenlétében nem volt nyilvánvaló, amikor az ePN vagy az iPN kimenetét blokkolták (3b., C. Ábra). Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy az AL idegsejtek és a PN-k részt vesznek a szaglási információ továbbításában a cLTM visszakeresése során, hasonlóan az összes korábban azonosított kontextustól független memóriakomponenshez. Ezzel szemben az MZ699-Gal4 jelzésű iPN-ek, amelyek az LH felé vetülnek ki, szükségesek a szagláshoz való szoktatáshoz, de a kontextustól független memória visszakereséséhez nincs szükség Az MZ699-Gal4 ilyen hatása azt jelenti, hogy az LH szerepet játszik a cLTM visszakeresésében.

A cLTM visszaszerzéséhez LH és AMMC neuronok szükségesek

Érdekes módon az LH neuronok több távoli agyrégióhoz kapcsolódnak25. Egy nemrégiben történt felfedezés arról számolt be, hogy az LH multiszenzoros bemeneteket kap a különböző érzékszervi rendszerek agyi régióiból44. Ide tartozik az antennás mechanoszenzoros és motoros központ (AMMC), amely a mechanoszenzoros információkat közli, a ventralis lateral protocerebrum (vlpr), amely a színlátásért felel33, valamint az ízlés és a hőmérséklet egyéb érintett területei32,45.Feltételeztük tehát, hogy az ilyen konvergáló neuronkapcsolatok több szenzoros modalitás segítségével közvetítik a cLTM visszakeresését.

Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez először az LH neuronok egy alcsoportjára összpontosítottunk, amelyek kapcsolódnak az AMMC-hez. Ez a központ különféle mechanoszenzoros jeleket kap Johnson szervétől, beleértve az érintést, a hallást, a propriocepciót és a szélérzékelést46, 47, 48, 49. Ezután továbbítja ezeket a jeleket más agyi régióknak, beleértve az LH25-et is. Az NP1004-Gal4 expressziós mintázatát az mCD8: GFP membrán célmarker festésével vizualizáltuk NP1004-Gal4-ben; UAS-mCD8: A GFP repül (4a. Ábra, bal panel). Valójában az NP1004-Gal4-gyel jelölt és immunfestéses AMMC-LH neuronok azt mutatták, hogy a syt :: GFP preszinaptikus marker (az eGFP és a szinaptikus hólyagfehérje szinaptotagmin fúziója) az NP1004-Gal4 LH-jában gazdagodik; UAS-syt :: GFP repül (4a. Ábra, jobb oldali panel), ami arra utal, hogy az AMMC-től az LH-ig szinaptikus kapcsolatok vannak.

Hősokk okozta reverzibilis blokád a szinaptikus transzmisszió károsodott cLTM visszakeresésében az NP1004-Gal4-ben; Az UAS-Shits repül (4b. Ábra). Ezt a megfigyelést alátámasztva az R38E07-Gal4 és NP0761-Gal4 jelölt AMMC neuronokban a szinaptikus transzmisszió blokkolása szintén elnyomta a cLTM visszakeresését (4c. Ábra és 4c. Kiegészítő ábra). Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a mechanoszenzoros információk reprezentációja az AMMC-LH neuronokon belül kritikus fontosságú a cLTM visszaszerzés szempontjából. Ennek a következtetésnek a további megerősítése érdekében blokkoltuk a mechanoszenzoros bemeneteket, az edzés után eltávolítottuk az aristát, amely Drosophila egyik fő mechanoszenzoros szerve. Az eredmények azt mutatták, hogy ez a kezelés károsította a cLTM-t (4d. Ábra), de nem volt hatással a tanulásra (kiegészítő 4d. Ábra), ami arra utal, hogy az AMMC-LH idegsejtek szerepet játszanak a cLTM-ben.

Ezután kalciumválaszokat képeztünk le az AMMC-LH idegsejtek LH terminálja mechanikus szenzoros inger után, apró kefével az arisztára (lásd: Módszerek szakasz). Ennek érdekében expresszáltuk a GCamP6f-t, egy kalcium-érzékeny fluoreszcens fehérjét50, amelyet NP1004-Gal4 hajtott. Ezután rögzítettük a GCamP6f fluoreszcenciáját az LH régiókból (4e. Ábra). Az LH régióban erőteljes válaszok érkeztek arra, hogy az arista hogyan érintkezik az ecsettel, alátámasztva azt a felfogást, hogy a mechanoszenzoros információkat az LH felé továbbítják az AMMC-LH neuronokon keresztül. AMMC neuronaktivitás az intracelluláris kalcium (TRIC) 51 transzkripciós riporterének felhasználásával, amely a legyek intracelluláris kalciumszintjével arányosan növeli a GFP expressziót. Az AMMC régióból származó TRIC fluoreszcenciáját 3 órával a visszaszerzés után kiszámítottuk, és a legyek irányítására normalizáltuk (4f. Ábra). Lényegesen nagyobb TRIC jelet figyeltek meg az AMMC-ben a kontextusfüggő visszakeresés után, mint a kontrolllégyeknél vagy a kontextustól független visszakeresés után, ami azt mutatja, hogy az AMMC neuronaktivitása jól korrelál a kontextustól függő visszakereséssel. Így az LH neuronok képesek integrálni az AMMC-ből származó mechanoszenzoros információkat és az AL-ból származó szaglási információkat a cLTM visszaszerzéséhez (4g. Ábra).

Az LH multiszenzoros integrációja a cLTM visszakeresés alapját képezi

Ezután tovább ellenőriztük, hogy más érzékszervi rendszerek is részt vettek-e ebben a folyamatban, például a vizuális rendszer. Blokkoltuk a vizuális bemenetet a hőmérsékletre érzékeny mutáns szarok (UAS-Shits; GMR-Gal4) és az optikai lebeny neuronok (UAS-Shits; R82D10-Gal4) célzott expressziójával a cLTM visszakeresés során (Kiegészítő 6a. Ábra). A cLTM-t mindkét esetben megszüntették, ami azt sugallja, hogy a vizuális rendszer is részt vesz a cLTM-visszakeresésben.

Az ilyen vizuális bemenet, valamint más potenciális szenzoros bemenetek állítólag konvergálnak az LH neuronokhoz, csakúgy, mint a mechanoszenzoros esetében bemenet. A presynaptic marker syt :: GFP célzott expresszióját hajtottuk végre a rendelkezésre álló Gal4 vonalakban, a következő LH neuronokat, az LH-hoz vezető mediális protocerebrumot (smpr-LH; MZ671-Gal4), a superior laterális protocerebrumot (ízlés szempontjából releváns52) LH-re (slpr -LH; NP3060-Gal4) és a ventrális laterális mediális protocerebrum (a visual33 szempontjából releváns) az LH-hoz (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. Az eredmények azt mutatták, hogy a megcélzott agyi régiókból származó előrejelzések összegyűlnek vagy szinapszisokat hoznak létre az LH régióban (5a. Ábra), ami arra utal, hogy a sokféle kontextus szerinti információt továbbítják az LH-nak.

Ezután teszteltük a jelölt idegsejtek manipulálásának hatásait a cLTM visszanyerésére. Az LH neuronok minden alcsoportjának szinaptikus átvitelének blokkolása megszüntette a cLTM visszakeresését (5b. Ábra és 5. kiegészítő ábra). A cLTM visszakeresését azonban nem befolyásolta az MB kimeneti idegsejtek blokkolása (MB-V2, amelyet NP2492-Gal4 jelzett), amelyek az LH felé vetülnek, ami a jelentések szerint a hagyományos LTM53 esetében szükséges volt. Erre a kapcsolatra lehet szükség a kontextustól független, averzív szaglási memória visszakereséséhez53,54. Így a cLTM visszakeresés magában foglalja más szenzoros agyi régiókból származó szinaptikus bemenetek integrálását az LH-ba (5c. Ábra).

Annak megállapításához, hogy ezek az LH neuronok is részt vesznek-e a hagyományos LTM visszakeresésében, blokkoltuk ezek az idegsejtek az időközönkénti edzés utáni visszakeresés során Az ilyen blokád nem gyakorolt hatást az LTM-re (Kiegészítő 5b. Ábra).

Az LH neuronok cLTM visszaszerzésében betöltött szerepének további érvényesítése érdekében teszteltük az LH kimeneti idegsejtek blokkolásának hatásait. Számos Gal4 törzset azonosítottak az LH kimeneti neuronok jelölésére44. A 24 órás cLTM nem volt nyilvánvaló, amikor a PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 vagy AV6b1 jelölt neuronok kimenetét blokkolták (5c. Kiegészítő ábra), míg az AD1e1 és AV6a1 nem. Ezek a megfigyelések azt bizonyítják, hogy az LH központi szerepet játszik a cLTM visszakeresésében.

A bemutatott adatokat és a kontextustól független memória-összetevők jelentett tanulmányával együtt javaslatot teszünk egy modellre a cLTM és LTM visszakereséséhez (ábra 6). Az LH multiszenzoros integrációja a cLTM visszakereshetőségét kapja, míg a kondicionált szag önmagában elegendő a kontextustól független memóriák visszakereséséhez.