Å gjeninnføre kobberristen i reagensglasset avslører cLTM

Alle tidligere publikasjoner som involverer aversiv olfaktorisk kondisjonering i Drosophila har brukt atferdsanalyseapparater og prosedyrer avledet av det samme designprinsippet10. Det vil si at fluene er trent i et treningsrør med en kobbergitteroverflate som gir elektriske støt (fig. 1a, venstre panel) og testet i testrør uten kobberristen (fig. 1a, midtpanel). I ingen tidligere studier har således henting av aversive minnekomponenter krevd tilstedeværelsen av kobbernettet. Da kobbergitteret ble satt tilbake i testrørene (fig. 1a, høyre panel) – en prosedyre som ikke påvirker luktstyrken (tilleggs Tab. 1) eller fører til falsk hukommelsesytelse (tilleggs Fig. 1a), avslørte atferdsanalysen slående effekter. Enkeltprøvekondisjonering produserte en kobbernettavhengig minnekomponent som opprettholdt lenger enn de som er sett tidligere, selv i gjentatte forsøk. Spesielt varte minnet i minst 14 dager, som var den lengste testede perioden (fig. 1b).

For å avgjøre om denne kobbernettavhengige minneforbedringen gjenspeiler de generelle effektene av gjeninnføring av kontekst, prøvde vi å endre andre elementer i treningsmiljøet, spesielt fargen på det omgivende lyset og omgivelsestemperaturen som fluer er i stand til å svare på begge 32,33. Da det røde treningslyset ble slått til gult under testing, eller omvendt, kunne minneforbedring ikke oppstå, selv når kobbergitteret ble levert (figur 1c og tilleggsbilde 1c). Tilsvarende forsvant forbedring når testtemperaturen var markant forskjellig fra læringstemperaturen (23 ° C mot 32 ° C, eller omvendt; Fig. 1c og tilleggs Fig. 1d). Endring av en hvilken som helst miljøtilstand i kodingskonteksten blokkerte derfor det kobbernettet-avhengige minnet fullstendig.

Forskjellen mellom kodingsmiljøet og testmiljøet måtte imidlertid være tilstrekkelig betydelig eller lett påviselig til å påvirke henting av det kobbernettavhengige minnet. For eksempel ble minneforbedring bevart når testtemperaturen ble endret fra en kodingstemperatur på 23 ° C til en testtemperatur på 25 ° C (tilleggs figur 1e).

I alle fall, henting av kobber rutenettavhengig minne krever betinget lukt og full gjeninnføring av den kodende miljøkonteksten. Dette er grunnen til at vi kalte denne minnekomponenten som kontekstavhengig LTM (cLTM).

cLTM krever ingen proteinsyntese-avhengig konsolidering

Siden de fleste studier bare har fremkalt LTM ved hjelp av avstandsopplæringsprotokoller , og fordi LTM er avhengig av proteinsyntese3, bestemte vi videre om proteinsyntese-avhengig konsolidering er nødvendig for cLTM.Bemerkelsesverdig var dannelsen av et slikt langvarig minne uavhengig av proteinsyntese, fordi administrering av cykloheksimid (CXM), en proteinsynteseinhibitor, ikke hadde noen innvirkning på cLTM-dannelse (figur 1d), mens den samme behandlingen blokkerte LTM-dannelse (tilleggs Fig. . 1f), som forventet 3,8,9. Til støtte for denne observasjonen viste inhibering av proteinsyntese gjennom pan-neuronal ekspresjon av RICIN34, et protein som inaktiverte eukaryote ribosomer, i transgene fluer (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) heller ingen effekt på cLTM-dannelse (Supplerende figur 1g). Vi bekreftet slik uavhengighet ytterligere gjennom pan-neuronal ekspresjon (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) av en repressor-isoform av cAMP-respons element-bindende protein 2 (CREB2b) som rapporteres å blokkere LTM5 i transgene fluer, hadde ingen innvirkning på cLTM ( Fig. 1g). Videre utførte klassisk læring og minne rutabaga (rut) mutanter, rut1 og rut2080, med dempet cAMP-syntese normal cLTM (fig. 1h). Data som presenteres antyder derfor sterkt at cLTM-dannelse ikke krever proteinsyntese og derfor er forskjellig fra den kontekstuavhengige LTM. cLTM skiller seg også fra anestesiresistent minne (ARM), for det forblir normalt i en reddiksmutant (tilleggsbilde 1h) mens ARM er svekket35.

For å validere disse overraskende funnene, bestemte vi oss for om dannelsen av cLTM tar tid, en annen indikasjon på konsolidering. For dette formål karakteriserte vi motstanden til cLTM mot kaldsjokkbehandling, som er kjent for å avskaffe korttids- og mellomtidsminne3,8. 24 timer etter trening forble cLTM upåvirket (figur 1d) av typisk kaldsjokkbehandling. Slik motstand mot kaldsjokk tillot oss å utføre to oppfølgingseksperimenter:

For det første brukte vi kaldsjokkbehandling i 2 minutter umiddelbart etter en kondisjoneringsforsøk. Etter 3 minutters hvile fra forkjølelsen, viste en atferdsanalyse at kaldstøtresistent cLTM allerede var dannet i full styrke (ca. 20% av utførelsesindeksen; figur 1e). For det andre, for ytterligere å validere observasjonen, reduserte vi styrken på treningselektrisk støt fra 60 til 20 V for å unngå takeffekter av minnestyrke. Vi fant ut at, selv ved en så svak treningsstyrke, ble cLTM dannet umiddelbart, fordi lignende forbedringer umiddelbart var tilstede i minnet, noe som indikerer at cLTM-dannelse som ble opprettholdt i lang tid uten å forfalle (figur 1f). Dermed blir cLTM dannet innen 3 minutter etter trening, noe som tyder på at ingen proteinsyntese-konsolidering er nødvendig for dannelsen.

Denne overraskende observasjonen fikk oss til å undersøke om cLTM er forskjellig fra tradisjonell LTM eller bare utgjør det samme minne hentet i forskjellige miljøkontekster. Flere bevislinjer, presentert nedenfor, antydet at cLTM er en distinkt minnekomponent med forskjellige molekylære og anatomiske trekk.

Dopaminerge nevroner er involvert i cLTM-dannelse

LTM-dannelse krever dopaminerge nevroner ( DAN-er), så vi undersøkte rollen som DAN-er i cLTM-koding, og sammenlignet 24-timers minne i kontrollfluer med fluer hvis synaptiske utganger fra DAN-er ble blokkert under trening. For dette formålet ble uttrykk for UAS-Shibirets1 (Shits) rettet mot DAN-er gjennom TH-Gal4, slik at normal synaptisk utgang var tillatt ved tillatt temperatur (23 ° C), men blokkert ved restriktive temperaturer (32 ° C) 36. For å sikre konsistente miljøforhold mellom trening og testing, vedtok vi et strengt regime for temperaturbehandlinger. Spesielt, for å blokkere synaptisk overføring under trening, ble fluer flyttet til et 32 ° C miljø 30 minutter før trening og tilbake til 23 ° C umiddelbart før trening. Deretter fullførte de opplæringen innen 5 minutter og ble testet 24 timer senere ved 23 ° C. Innenfor det gitte tidsvinduet (5 min), forble synaptisk overføring av nevroner som uttrykker Shits blokkert (tilleggs figur 2a). På samme måte, når det gjelder analyser som krevde neuronblokkade under testing, ble fluer flyttet til et 32 ° C-miljø før testing, men ble trent og testet ved 23 ° C (figur 2a). Resultatene viste at blokkering av frigjøring av nevrotransmitter fra TH-Gal4-merkede nevroner svekket cLTM-dannelse, noe som tyder på at DAN-er kreves for cLTM-koding. Denne konklusjonen ble ytterligere støttet av atferdsanalysen, som viste at ingen cLTM skjedde i Drosophila D1 dopaminreseptoren (dDA1) -mutante fluer (dDA1dumb2) 37 eller i fluer med pan-neuronal nedslag av dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb -Gal4) (fig. 2b). Dette antyder at dDA1-mediert neuromodulasjon spiller en rolle i cLTM-anskaffelse.

DDA1er uttrykt i MB-neuroner var imidlertid ikke involvert i cLTM-anskaffelse, fordi målrettet overekspresjon av dDA1 i MB-neuroner på en dDA1dumb2-mutant bakgrunn (dDA1dumb2; OK107-Gal4) ikke klarte å redde cLTM-anskaffelse. I samsvar med dette påvirket ikke dDA1-nedslag i MB-neuroner (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) ikke cLTM. Disse dataene antyder at cLTM er kodet av dDA1-mediert neuromodulasjon, men ikke i MB. ikke involvert i cLTM-anskaffelse, mens alle tidligere studier innen dette feltet har funnet at dannelse av kontekstuavhengige, aversive minnekomponenter, inkludert tradisjonell LTM, involverer MB-neuroner38,39,40,41. For å bekrefte denne observasjonen, undersøkte vi rollene til MB-neuroner i cLTM-gjenfinning. For dette formål ble uttrykk for UAS-Shits målrettet mot MB-neuroner gjennom to uavhengige Gal4-drivere: OK107-Gal4 og C772-Gal4 (Supplerende figur 2b, c). Selv om LTM-gjenfinning mislyktes i OK107-Gal4; UAS-Shits-fluer (tilleggs Fig. 2d), forble cLTM intakt i OK107-Gal4; UAS-Shits og C772-Gal4; UAS-Shits fluer (Fig. 2c, d), og bekreftet at MB-neuroner er ikke involvert i dannelsen eller hentingen av cLTM.

Å hente cLTM krever AL- og projeksjonsneuroner

For å identifisere hvilke hjerneregioner som kreves for cLTM-gjenfinning, undersøkte vi rollen til AL lokale nevroner og projeksjonsneuroner (PN-er). Olfaktorisk informasjon i fluer blir videreformidlet fra sensoriske nevroner til AL-nerveceller og PN-er som deretter splitter seg til MB og LH42. Vi testet først effekten av å blokkere synaptisk utgang fra AL lokale nevroner merket av OK66-Gal4 (tilleggs Fig. 3a). Blokkering av synaptisk overføring ved restriktiv temperatur avskaffet cLTM i OK66-Gal4; UAS-Shits fluer (fig. 3a). Vi testet deretter effekten av to forskjellige undergrupper av projeksjonsneuroner, med eksitatoriske projeksjonsneuroner (ePNer) som projiserer til både MB og LH, merket av GH146-Gal4 (tilleggs Fig. 3b), og hemmende projeksjonsneuroner (iPNs) som bare projiserer til LH-regionen, merket av MZ699-Gal4 (tilleggs figur 3c). Forbedringen av 24-timers minne i nærvær av rutenett var ikke tydelig når utgangen fra verken ePN eller iPN ble blokkert (figur 3b, c). Disse observasjonene viser at AL-neuroner og PN-er deltar i olfaktorisk informasjonsoverføring under cLTM-henting, som med alle tidligere identifiserte kontekstuavhengige minnekomponenter. I motsetning til dette kreves iPN-er merket med MZ699-Gal4, som projiserer til LH, for olfaktorisk tilvenning, men ikke gjenfinning av kontekstuavhengig minne28,43. Denne effekten av MZ699-Gal4 innebærer at LH spiller en rolle i cLTM-henting.

Henting av cLTM krever LH- og AMMC-neuroner

Interessant, LH-neuroner er koblet til flere fjerntliggende hjerneregioner25. En nylig oppdagelse rapporterer at LH mottar multisensoriske innganger fra hjerneområder i forskjellige sensoriske systemer44. Disse inkluderer antennemekanosensorisk og motorsenter (AMMC), som kommuniserer mekanosensorisk informasjon, ventral lateral protocerebrum (vlpr), som er ansvarlig for fargesyn33, og andre områder som er involvert i smak og temperatur32,45.Vi antok dermed at slike konvergerende nevronale forbindelser formidler cLTM-gjenfinning ved bruk av flere sensoriske modaliteter.

For å teste denne hypotesen fokuserte vi først på en undergruppe av LH-neuroner knyttet til AMMC. Dette senteret mottar forskjellige mekanosensoriske signaler fra Johnsons organ, inkludert berøring, hørsel, propriosepsjon og vindfølelse46,47,48,49. Den videreformidler disse signalene til andre hjerneområder, inkludert LH25. Ekspresjonsmønsteret til NP1004-Gal4 ble visualisert ved farging av membranmålmarkøren mCD8: GFP i NP1004-Gal4; UAS-mCD8: GFP fluer (fig. 4a, venstre panel). AMMC-LH-neuroner merket av NP1004-Gal4 og immunfarging viste faktisk at det presynaptiske markørsystemet :: GFP (en fusjon av eGFP og synaptisk vesikkelprotein synaptotagmin) er beriket i LH av NP1004-Gal4; UAS-syt :: GFP flyr (fig. 4a, høyre panel), noe som tyder på at det er synaptiske forbindelser fra AMMC til LH.

Varmesjokkindusert reversibel blokkering av synaptisk overføring svekket cLTM-gjenfinning i NP1004-Gal4; UAS-Shits fluer (fig. 4b). Bekreftende denne observasjonen undertrykte også blokkering av synaptisk overføring i AMMC-neuroner merket med R38E07-Gal4 og NP0761-Gal4 cLTM-gjenfinning (fig. 4c og tilleggs Fig. 4c). Disse resultatene antyder at representasjonen av mekanosensorisk informasjon i AMMC-LH-nerveceller er kritisk for cLTM-gjenfinning. For ytterligere å bekrefte denne konklusjonen, blokkerte vi mekanosensoriske innganger via fjerning av arista, som er et viktig mekanosensorisk organ i Drosophila, etter trening. Resultatene viste at denne behandlingen svekket cLTM (Fig. 4d), men ikke hadde noen innvirkning på læring (Supplerende Fig. 4d), noe som antydet en rolle for AMMC-LH-neuroner i cLTM.

Deretter avbildet vi kalsiumresponser i LH-terminalen av AMMC-LH-neuroner etter mekanosensorisk stimulus påført med en liten børste på aristaen (se Metodeavsnitt). For dette formål uttrykte vi GCamP6f, et kalsiumfølsomt fluorescerende protein50, drevet av NP1004-Gal4. Vi registrerte deretter fluorescensen av GCamP6f fra LH-regionene (fig. 4e). Det var robuste svar på arista-kontakt med børsten i LH-regionen, og støttet forestillingen om at mekanosensorisk informasjon blir videreformidlet til LH gjennom AMMC-LH-neuroner.

For å bekrefte at disse observasjonene var atferdsmessig signifikante, overvåket vi AMMC nevronaktivitet ved hjelp av transkripsjonsreporteren av intracellulært kalsium (TRIC) 51, noe som øker GFP-uttrykk proporsjonalt med intracellulært kalsiumnivå i fluer. Fluorescensen til TRIC fra AMMC-regionen ble beregnet 3 timer etter henting og normalisert for å kontrollere fluer (figur 4f). Signifikant større TRIC-signal ble observert i AMMC etter kontekstavhengig gjenfinning enn i kontrollfluer eller etter kontekstuavhengig gjenfinning, noe som viser at AMMC neuronal aktivitet korrelerer godt med kontekstavhengig gjenfinning. Dermed er LH-neuroner i stand til å integrere mekanosensorisk informasjon fra AMMC og luktinformasjon fra AL for å hente cLTM (fig. 4g).

Multisensorisk integrasjon i LH ligger til grunn for cLTM-henting

Vi bekreftet videre om andre sensoriske systemer også var involvert i denne prosessen, for eksempel det visuelle systemet. Vi blokkerte visuell inngang gjennom målrettet ekspresjon av temperaturfølsomme mutante shits i øynene (UAS-Shits; GMR-Gal4) og de optiske lobneuronene (UAS-Shits; R82D10-Gal4) under cLTM-gjenfinning (Supplerende figur 6a). cLTM ble avskaffet i begge tilfeller, noe som tyder på at det visuelle systemet også er involvert i cLTM-gjenfinning.

Slike visuelle innganger så vel som andre potensielle sensoriske innganger tilsynelatende konvergerer til LH-neuroner, akkurat som i tilfellet med mekanosensorisk inngang. Vi utførte målrettet uttrykk for det presynaptiske markørsystemet :: GFP i tilgjengelige Gal4-linjer, og merket følgende LH-neuroner, overlegen medial protocerebrum til LH (smpr-LH; MZ671-Gal4), overlegen lateral protocerebrum (relevant for smak52) til LH (slpr -LH; NP3060-Gal4) og ventral lateral medial protocerebrum (relevant for visual33) til LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. Resultatene viste at projeksjoner fra målrettede hjerneområder samles, eller lager synapser, i LH-regionen (fig. 5a), noe som tyder på at mangfoldig kontekstuell informasjon blir videreformidlet til LH.

Vi testet deretter effekten av å manipulere de merkede nevronene på cLTM-gjenfinning. Blokkering av synaptisk overføring av hver undergruppe av LH-neuroner avskaffet cLTM-gjenfinning (figur 5b og tilleggsfigur 5). Imidlertid ble cLTM-gjenfinning ikke påvirket av blokkering av MB-utgangsneuroner (MB-V2, merket av NP2492-Gal4) som prosjekterte til LH, som ble rapportert nødvendig for tradisjonell LTM53. Denne forbindelsen kan være nødvendig for å hente kontekstuavhengig aversivt olfaktorisk minne53,54. Dermed innebærer cLTM-gjenfinning også integrering av synaptiske innganger fra andre distinkte sensoriske hjerneområder til LH (fig. 5c).

For å bestemme om disse LH-neuronene også er involvert i gjenfinning av den tradisjonelle LTM, blokkerte vi disse nevronene under gjenfinning etter trening i mellomrom. En slik blokkering utøvde ingen innvirkning på LTM (supplerende figur 5b).

For ytterligere å validere en rolle som LH-neuroner i gjenfinning av cLTM, testet vi deretter effekten av å blokkere LH-utgangsneuroner. Et antall Gal4-stammer er identifisert for å merke LH-utgangsneuroner44. 24-timers cLTM var ikke tydelig da produksjonen fra nevroner merket av PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 eller AV6b1 ble blokkert (tilleggsbilde 5c), mens AD1e1 og AV6a1 ikke var det. Disse observasjonene viser at LH spiller en sentral rolle i cLTM-gjenfinning.

Tar vi dataene presentert sammen med den rapporterte studien av kontekstuavhengige minnekomponenter, blir vi ledet til å foreslå en modell for cLTM- og LTM-gjenfinning (Fig. . 6). Multisensorisk integrasjon i LH-portene er gjenvinnbarheten av cLTM mens kondisjonert lukt alene er tilstrekkelig for å hente kontekstuavhengige minner.