Reintegrar a grade de cobre ao tubo de ensaio revela cLTM

Todas as publicações anteriores envolvendo condicionamento olfativo aversivo em Drosophila têm usado aparelhos de ensaio comportamental e procedimentos derivados do mesmo princípio de projeto10. Ou seja, as moscas são treinadas em um tubo de treinamento com superfície de grade de cobre que emite choques elétricos (Fig. 1a, painel esquerdo) e testadas em tubos de ensaio sem grade de cobre (Fig. 1a, painel do meio). Assim, em nenhum estudo anterior a recuperação de componentes aversivos da memória exigiu a presença da grade de cobre. Quando a grade de cobre foi reinstalada nos tubos de teste (Fig. 1a, painel direito) – um procedimento que não afeta a acuidade do odor (Tab. Suplementar 1) ou leva ao desempenho de falsa memória (Fig. 1a Complementar), o ensaio comportamental revelou efeitos marcantes. O condicionamento de teste único produziu um componente de memória dependente da grade de cobre que durou mais do que aqueles vistos anteriormente, mesmo em testes espaçados e repetidos. Especificamente, a memória durou pelo menos 14 dias, que foi o período mais longo testado (Fig. 1b).

Para determinar se este aprimoramento da memória dependente da grade de cobre reflete os efeitos gerais da restauração do contexto, tentamos alterar outros elementos do ambiente de treinamento, especificamente a cor da luz circundante e a temperatura ambiente como moscas são capazes de responder a ambos32,33. Quando a luz de treinamento vermelha foi mudada para amarelo no teste, ou vice-versa, o aumento da memória não ocorreu, mesmo quando a grade de cobre foi fornecida (Fig. 1c e Fig. 1c Suplementar). Da mesma forma, o realce desapareceu quando a temperatura de teste foi marcadamente diferente da temperatura de aprendizagem (23 ° C vs. 32 ° C, ou vice-versa; Fig. 1c e Fig. 1d complementar). Portanto, alterar qualquer condição ambiental do contexto de codificação bloqueou completamente a memória dependente da grade de cobre.

No entanto, a diferença entre o ambiente de codificação e o ambiente de teste tinha que ser suficientemente significativa ou facilmente detectável para afetar a recuperação de a memória dependente da grade de cobre. Por exemplo, o aprimoramento da memória foi preservado quando a temperatura de teste foi alterada de uma temperatura de codificação de 23 ° C para uma temperatura de teste de 25 ° C (Fig. 1e Complementar).

Em qualquer caso, recuperação de cobre a memória dependente da grade requer odor condicionado e restauração total do contexto do ambiente de codificação. É por isso que denominamos este componente de memória como LTM dependente do contexto (cLTM).

cLTM não requer consolidação dependente da síntese de proteínas

Uma vez que a maioria dos estudos eliciou apenas LTM usando protocolos de treinamento espaçados , e porque a LTM depende da síntese de proteínas3, determinamos ainda se a consolidação dependente da síntese de proteínas é necessária para cLTM.Notavelmente, a formação de tal memória de longa duração era independente da síntese de proteínas, porque a administração de cicloheximida (CXM), um inibidor da síntese de proteínas, não teve impacto na formação de cLTM (Fig. 1d), enquanto o mesmo tratamento bloqueou a formação de LTM (Fig complementar . 1f), conforme esperado3,8,9. Em apoio a esta observação, a inibição da síntese de proteínas por meio da expressão pan-neuronal de RICIN34, uma proteína que inativa ribossomos eucarióticos, em moscas transgênicas (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) também não mostrou nenhum efeito na formação de cLTM (Fig. Suplementar 1g). Confirmamos essa independência adicionalmente através da expressão pan-neuronal (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) de uma isoforma repressora da proteína de ligação ao elemento de resposta de cAMP 2 (CREB2b) que é relatado para bloquear LTM5 em moscas transgênicas não teve impacto sobre cLTM ( Fig. 1g). Além disso, os mutantes rutabaga (rut) de memória clássica e de aprendizagem, rut1 e rut2080, com síntese de cAMP atenuada, realizaram cLTM normal (Fig. 1h). Assim, os dados apresentados sugerem fortemente que a formação de cLTM não requer síntese de proteínas e, portanto, é diferente do LTM independente do contexto. O cLTM também é distinguível da memória resistente à anestesia (ARM), pois permanece normal em um mutante de rabanete (Fig. Suplementar 1h) enquanto o ARM está prejudicado35.

Para validar esses achados surpreendentes, determinamos se a formação de O cLTM leva tempo, outra indicação de consolidação. Para tanto, caracterizamos a resistência do cLTM ao tratamento de choque frio, que é conhecido por abolir a memória de curto e médio prazo3,8. Vinte e quatro horas após o treinamento, cLTM permaneceu inalterado (Fig. 1d) pelo tratamento típico de choque frio. Essa resistência ao choque frio nos permitiu realizar dois experimentos de acompanhamento:

Em primeiro lugar, aplicamos o tratamento ao choque frio por 2 minutos imediatamente após um ensaio de condicionamento. Após 3 min de repouso do choque frio, um ensaio comportamental mostrou que o cLTM resistente ao choque frio já estava formado com força total (cerca de 20% do índice de desempenho; Fig. 1e). Em segundo lugar, para validar ainda mais a observação, reduzimos a força do choque elétrico de treinamento de 60 para 20 V para evitar qualquer efeito teto da força da memória. Descobrimos que, mesmo com uma força de treinamento tão fraca, cLTM foi formado imediatamente, porque melhorias semelhantes estavam imediatamente presentes na memória, indicando que a formação de cLTM que foi sustentada por um longo tempo sem se deteriorar (Fig. 1f). Assim, cLTM é formado dentro de 3 min após o treinamento, sugerindo que nenhuma consolidação de síntese de proteína é necessária para sua formação.

Esta observação surpreendente nos levou a investigar se cLTM é diferente de LTM tradicional ou apenas constitui o mesmo memória recuperada em diferentes contextos ambientais. Múltiplas linhas de evidência, apresentadas abaixo, sugeriram que cLTM é um componente de memória distinto com diferentes características moleculares e anatômicas.

Neurônios dopaminérgicos estão envolvidos na formação de cLTM

A formação de LTM requer neurônios dopaminérgicos ( DANs), então examinamos o papel dos DANs na codificação cLTM, comparando a memória de 24 horas em moscas de controle com a de moscas cujas saídas sinápticas de DANs foram bloqueadas durante o treinamento. Para este propósito, a expressão de UAS-Shibirets1 (Shits) foi direcionada a DANs por meio de TH-Gal4, de modo que a saída sináptica normal foi permitida em temperaturas permissivas (23 ° C), mas bloqueada em temperaturas restritivas (32 ° C) 36. Para garantir condições ambientais consistentes entre o treinamento e o teste, adotamos um regime estrito para tratamentos de temperatura. Especificamente, para bloquear a transmissão sináptica durante o treinamento, as moscas foram movidas para um ambiente de 32 ° C 30 minutos antes do treinamento e de volta a 23 ° C imediatamente antes do treinamento. Em seguida, eles completaram o treinamento em 5 minutos e foram testados 24 horas depois a 23 ° C. Dentro da janela de tempo dada (5 min), a transmissão sináptica de neurônios que expressam Shits permaneceu bloqueada (Fig. 2a complementar). Da mesma forma, no caso de ensaios que exigiam bloqueio de neurônios durante o teste, as moscas foram movidas para um ambiente de 32 ° C antes do teste, mas foram treinadas e testadas a 23 ° C (Fig. 2a). Os resultados mostraram que o bloqueio da liberação de neurotransmissor de neurônios marcados com TH-Gal4 prejudicou a formação de cLTM, sugerindo que os DANs são necessários para a codificação de cLTM. Esta conclusão foi ainda apoiada pelo ensaio comportamental, que mostrou que nenhum cLTM ocorreu nas moscas mutantes do receptor de dopamina Drosophila D1 (dDA1) (dDA1dumb2) 37 ou em moscas com knockdown pan-neuronal de dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb -Gal4) (Fig. 2b). Isso sugere que a neuromodulação mediada por dDA1 desempenha um papel na aquisição de cLTM.

No entanto, dDA1s expressos em neurônios MB não estavam envolvidos na aquisição de cLTM, porque a superexpressão direcionada de dDA1 em neurônios MB em um fundo mutante dDA1dumb2 (dDA1dumb2; OK107-Gal4) falhou em resgatar a aquisição de cLTM. Consistente com isso, o knockdown de dDA1 em neurônios MB (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) não afetou cLTM. Esses dados sugerem que cLTM é codificado por neuromodulação mediada por dDA1, mas não no MB.

A recuperação de cLTM é independente dos neurônios do corpo em cogumelo

Curiosamente, dDA1s nos neurônios MB foram não está envolvido na aquisição de cLTM, enquanto todos os estudos anteriores neste campo descobriram que a formação de componentes de memória aversivos e independentes de contexto, incluindo LTM tradicional, envolve neurônios MB38,39,40,41. Para confirmar esta observação, examinamos as funções dos neurônios MB na recuperação cLTM. Para este fim, a expressão de UAS-Shits foi direcionada aos neurônios MB por meio de dois drivers Gal4 independentes: OK107-Gal4 e C772-Gal4 (Fig. 2b, c suplementar). Embora a recuperação de LTM falhou em OK107-Gal4; UAS-Shits voa (Fig. 2d complementar), cLTM permaneceu intacto em OK107-Gal4; UAS-Shits e C772-Gal4; UAS-Shits voou (Fig. 2c, d), confirmando que Os neurônios MB não estão envolvidos na formação ou recuperação de cLTM.

Recuperar cLTM requer AL e neurônios de projeção

Para identificar quais regiões do cérebro são necessárias para a recuperação de cLTM, investigamos o papel de Neurônios locais AL e neurônios de projeção (PNs). A informação olfativa nas moscas é retransmitida dos neurônios sensoriais para os neurônios AL e PNs que então se bifurcam para o MB e o LH42. Primeiro testamos os efeitos do bloqueio da saída sináptica dos neurônios locais AL marcados por OK66-Gal4 (Fig. 3a suplementar). O bloqueio da transmissão sináptica em temperatura restritiva aboliu o cLTM em OK66-Gal4; UAS-Shits voa (Fig. 3a). Em seguida, testamos os efeitos de dois subgrupos distintos de neurônios de projeção, com neurônios de projeção excitatórios (ePNs) projetando-se para ambos MB e LH, marcados por GH146-Gal4 (Fig. Suplementar 3b), e neurônios de projeção inibitórios (iPNs) projetando apenas a região LH, marcada por MZ699-Gal4 (Fig. 3c complementar). O aprimoramento da memória de 24 horas na presença de grades não foi evidente quando a saída de ePNs ou iPNs foi bloqueada (Fig. 3b, c). Essas observações demonstram que os neurônios AL e PNs participam da transmissão de informações olfativas durante a recuperação de cLTM, como com todos os componentes de memória independentes do contexto identificados anteriormente. Em contraste, iPNs marcados com MZ699-Gal4, que se projetam para o LH, são necessários para habituação olfativa, mas não para recuperação de memória independente de contexto28,43. Este efeito de MZ699-Gal4 implica que o LH desempenha um papel na recuperação de cLTM.

A recuperação de cLTM requer neurônios LH e AMMC

Curiosamente, os neurônios LH estão conectados a várias regiões remotas do cérebro25. Uma descoberta recente relata que o LH recebe entradas multissensoriais de regiões do cérebro de vários sistemas sensoriais44. Incluem o centro mecanossensorial e motor da antena (AMMC), que comunica informações mecanossensoriais, o protocerebrum ventral lateral (vlpr), responsável pela visão de cores33, e outras áreas envolvidas no paladar e na temperatura32,45.Assim, formulamos a hipótese de que essas conexões neuronais convergentes medeiam a recuperação de cLTM usando várias modalidades sensoriais.

Para testar essa hipótese, primeiro nos concentramos em um subgrupo de neurônios LH ligados ao AMMC. Este centro recebe diversos sinais mecanossensoriais do órgão de Johnson, incluindo tato, audição, propriocepção e detecção do vento46,47,48,49. Em seguida, ele retransmite esses sinais para outras regiões do cérebro, incluindo o LH25. O padrão de expressão de NP1004-Gal4 foi visualizado por coloração do marcador de membrana alvo mCD8: GFP em NP1004-Gal4; UAS-mCD8: GFP voa (Fig. 4a, painel esquerdo). Na verdade, os neurônios AMMC-LH marcados por NP1004-Gal4 e a imunocoloração mostraram que o marcador pré-sináptico syt :: GFP (uma fusão de eGFP e a proteína da vesícula sináptica sinaptotagmina) é enriquecido no LH de NP1004-Gal4; UAS-syt :: GFP voa (Fig. 4a, painel direito), sugerindo que há conexões sinápticas do AMMC para o LH.

O bloqueio reversível induzido por choque térmico da transmissão sináptica prejudicou a recuperação de cLTM em NP1004-Gal4; UAS-Shits voa (Fig. 4b). Corroborando esta observação, o bloqueio da transmissão sináptica em neurônios AMMC marcados com R38E07-Gal4 e NP0761-Gal4 também suprimiu a recuperação de cLTM (Fig. 4c e Fig. 4c suplementar). Esses resultados sugerem que a representação da informação mecanossensorial dentro dos neurônios AMMC-LH é crítica para a recuperação de cLTM. Para confirmar ainda mais essa conclusão, bloqueamos as entradas mecanossensoriais removendo a arista, que é um importante órgão mecanossensorial em Drosophila, após o treinamento. Os resultados mostraram que este tratamento prejudicou o cLTM (Fig. 4d), mas não teve impacto na aprendizagem (Suplementar Fig. 4d), sugerindo um papel para os neurônios AMMC-LH no cLTM.

Em seguida, imaginamos as respostas do cálcio em o terminal LH dos neurônios AMMC-LH após estímulo mecanossensorial aplicado com uma pequena escova na arista (consulte a seção Métodos). Para esse fim, expressamos GCamP6f, uma proteína fluorescente sensível ao cálcio50, impulsionada por NP1004-Gal4. Em seguida, registramos a fluorescência de GCamP6f das regiões LH (Fig. 4e). Houve respostas robustas ao contato do arista com a escova na região de LH, apoiando a noção de que a informação mecanossensorial é retransmitida para o LH por meio de neurônios AMMC-LH.

Para confirmar que essas observações foram comportamentais significativas, monitoramos Atividade neuronal AMMC usando o repórter transcricional de cálcio intracelular (TRIC) 51, que aumenta a expressão de GFP em proporção aos níveis de cálcio intracelular em moscas. A fluorescência do TRIC da região AMMC foi calculada 3 h após a recuperação e normalizada para controlar moscas (Fig. 4f). Sinal TRIC significativamente maior foi observado no AMMC após a recuperação dependente do contexto do que nas moscas controle ou após a recuperação independente do contexto, mostrando que a atividade neuronal AMMC se correlaciona bem com a recuperação dependente do contexto. Assim, os neurônios LH são capazes de integrar informações mecanossensoriais do AMMC e informações olfativas do AL para recuperar cLTM (Fig. 4g).

A integração multissensorial no LH é a base da recuperação do cLTM

Em seguida, verificamos se outros sistemas sensoriais também estavam envolvidos neste processo, como o sistema visual. Nós bloqueamos a entrada visual através da expressão direcionada de Shits mutantes sensíveis à temperatura nos olhos (UAS-Shits; GMR-Gal4) e os neurônios do lobo óptico (UAS-Shits; R82D10-Gal4) durante a recuperação de cLTM (Fig. 6a suplementar). O cLTM foi abolido em ambos os casos, sugerindo que o sistema visual também está envolvido na recuperação do cLTM.

Tal entrada visual, bem como outras entradas sensoriais potenciais, supostamente convergem para os neurônios LH, assim como no caso do mecanossensorial entrada. Realizamos a expressão direcionada do marcador pré-sináptico syt :: GFP em linhas Gal4 disponíveis, marcando os seguintes neurônios LH, protocerebrum medial superior para LH (smpr-LH; MZ671-Gal4), protocerebrum lateral superior (relevante para o gosto52) para LH (slpr -LH; NP3060-Gal4) e protocerebrum ventral lateral medial (relevante para visual33) para LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. Os resultados mostraram que as projeções de regiões cerebrais alvo se congregam, ou fazem sinapses, na região LH (Fig. 5a), sugerindo que diversas informações contextuais são retransmitidas para o LH.

Em seguida, testamos os efeitos da manipulação dos neurônios marcados na recuperação de cLTM. O bloqueio da transmissão sináptica de cada subgrupo de neurônios LH aboliu a recuperação de cLTM (Fig. 5b e Fig. 5 complementar). No entanto, a recuperação de cLTM não foi afetada pelo bloqueio dos neurônios de saída do MB (MB-V2, rotulado por NP2492-Gal4) que se projetam para o LH, o que foi relatado como necessário para o LTM53 tradicional. Essa conexão pode ser necessária para a recuperação da memória olfativa aversiva independente do contexto53,54. Assim, a recuperação de cLTM também envolve a integração de entradas sinápticas de outras regiões cerebrais sensoriais distintas para o LH (Fig. 5c).

Para determinar se esses neurônios LH também estão envolvidos na recuperação do LTM tradicional, bloqueamos esses neurônios durante a recuperação após o treinamento espaçado. Tal bloqueio não exerceu impacto sobre a LTM (Fig. Suplementar 5b).

Para validar ainda mais o papel dos neurônios LH na recuperação de cLTM, testamos então os efeitos do bloqueio dos neurônios de saída de LH. Uma série de cepas de Gal4 são identificadas para rotular os neurônios de saída de LH44. O cLTM de 24 h não foi evidente quando a saída dos neurônios marcados por PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 ou AV6b1 foi bloqueada (Fig. Suplementar 5c), enquanto AD1e1 e AV6a1 não foram. Estas observações demonstram que o LH desempenha um papel central na recuperação de cLTM.

Tomando os dados apresentados juntamente com o estudo relatado dos componentes de memória independentes do contexto, somos levados a propor um modelo para a recuperação de cLTM e LTM (Figura . 6). Integração multissensorial nas portas LH a recuperabilidade de cLTM enquanto o odor condicionado sozinho é suficiente na recuperação de memórias independentes de contexto.