Ponowne umieszczenie siatki miedzianej w probówce ujawnia cLTM

Wszystkie poprzednie publikacje obejmujące awersyjne kondycjonowanie węchowe u Drosophila wykorzystywały aparaturę do testów behawioralnych i procedury wywodzące się z tej samej zasady projektowania10. Oznacza to, że muchy są trenowane w rurze treningowej z miedzianą siatką, która powoduje porażenie prądem elektrycznym (rys. 1a, panel lewy) i testowane w probówkach bez siatki miedzianej (rys. 1a, panel środkowy). Tak więc w żadnym z poprzednich badań nie było potrzeby odzyskania składników pamięci awersyjnej obecności siatki miedzianej. Po ponownym umieszczeniu siatki miedzianej w probówkach (rys. 1a, prawy panel) – procedura, która nie wpływa na ostrość zapachu (Tab. Uzupełniająca 1) ani nie prowadzi do fałszywego działania pamięci (Rys. Uzupełniający 1a), test behawioralny ujawnił uderzające efekty. Kondycjonowanie w pojedynczej próbie wytworzyło zależny od siatki miedzianej komponent pamięci, który trwał dłużej niż obserwowane wcześniej, nawet w rozstawionych, powtarzanych próbach. W szczególności pamięć trwała co najmniej 14 dni, co było najdłuższym badanym okresem (ryc. 1b).

Aby ustalić, czy to ulepszenie pamięci zależne od siatki miedzianej odzwierciedla ogólne skutki przywracania kontekstu, próbowaliśmy zmienić inne elementy środowiska treningowego, w szczególności kolor otaczającego światła i temperaturę otoczenia w locie są w stanie odpowiedzieć na oba pytania32,33. Kiedy czerwone światło treningowe zostało przełączone na żółte podczas testowania lub odwrotnie, wzmocnienie pamięci nie wystąpiło, nawet gdy zapewniono siatkę miedzianą (ryc. 1c i uzupełniający ryc. 1c). Podobnie wzmocnienie znikało, gdy temperatura badania znacznie różniła się od temperatury uczenia się (23 ° C vs 32 ° C lub odwrotnie; Rys. 1c i Dodatkowy Rys. 1d). Dlatego zmiana dowolnego warunku środowiskowego kontekstu kodowania całkowicie zablokowała pamięć zależną od siatki miedzianej.

Jednak różnica między środowiskiem kodowania a środowiskiem testowym musiała być wystarczająco duża lub łatwa do wykrycia, aby wpłynąć na pobieranie pamięć zależna od siatki miedzianej. Na przykład wzmocnienie pamięci zostało zachowane, gdy temperatura testowania została zmieniona z temperatury kodowania 23 ° C na temperaturę testową 25 ° C (rysunek uzupełniający 1e).

W każdym przypadku odzyskiwanie miedzi Pamięć zależna od sieci wymaga uwarunkowanego zapachu i pełnego przywrócenia kodowania kontekstu środowiskowego. Dlatego nazwaliśmy ten komponent pamięci jako LTM zależny od kontekstu (cLTM).

cLTM nie wymaga konsolidacji zależnej od syntezy białek

Ponieważ większość badań wywołała LTM tylko przy użyciu protokołów treningu z odstępami , a ponieważ LTM zależy od syntezy białek3, określiliśmy dalej, czy konsolidacja zależna od syntezy białek jest konieczna dla cLTM.Co ciekawe, tworzenie takiej pamięci długotrwałej było niezależne od syntezy białek, ponieważ podawanie cykloheksymidu (CXM), inhibitora syntezy białek, nie miało wpływu na tworzenie cLTM (ryc. 1d), podczas gdy to samo leczenie blokowało tworzenie LTM (uzupełniający ryc. . 1f), zgodnie z oczekiwaniami3,8,9. Na poparcie tej obserwacji, hamowanie syntezy białek poprzez panneuronalną ekspresję RICIN34, białka inaktywującego eukariotyczne rybosomy, u much transgenicznych (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) również nie miało wpływu na tworzenie cLTM (rysunek uzupełniający 1g). Potwierdziliśmy tę niezależność dalej poprzez ekspresję panneuronalną (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) represora izoformy białka wiążącego element odpowiedzi cAMP 2 (CREB2b), która, jak podano, blokuje LTM5 u much transgenicznych, nie miała wpływu na cLTM ( Rys. 1g). Co więcej, klasyczne mutanty rutabaga (rut) uczenia się i pamięci, rut1 i rut2080, z atenuowaną syntezą cAMP przeprowadzały normalny cLTM (ryc. 1h). Zatem przedstawione dane silnie sugerują, że tworzenie cLTM nie wymaga syntezy białek, a zatem różni się od niezależnej od kontekstu LTM. cLTM można również odróżnić od pamięci odpornej na znieczulenie (ARM), ponieważ pozostaje ona normalna u mutanta rzodkiewki (rysunek uzupełniający 1h), podczas gdy ARM jest upośledzona35.

Aby zweryfikować te zaskakujące odkrycia, ustaliliśmy, czy cLTM wymaga czasu, co jest kolejnym przejawem konsolidacji. W tym celu scharakteryzowaliśmy odporność cLTM na leczenie szokiem zimnym, o którym wiadomo, że znosi pamięć krótkotrwałą i średnioterminową3,8. Dwadzieścia cztery godziny po treningu cLTM pozostawał niezmieniony (ryc. 1d) po typowym leczeniu szokiem zimnym. Taka odporność na szok zimnem pozwoliła nam przeprowadzić dwa kolejne eksperymenty:

Po pierwsze, zastosowaliśmy szok zimnem przez 2 minuty bezpośrednio po jednej próbie kondycjonowania. Po 3 minutach odpoczynku od szoku zimnem, test behawioralny wykazał, że cLTM odporny na zimny szok uformował się już w pełnej sile (około 20% wskaźnika wydajności; ryc. 1e). Po drugie, aby jeszcze bardziej zweryfikować obserwację, zredukowaliśmy siłę porażenia prądem treningowym z 60 do 20 V, aby uniknąć jakichkolwiek efektów pułapowych siły pamięci. Stwierdziliśmy, że nawet przy tak słabej sile treningowej cLTM powstawał natychmiast, ponieważ podobne ulepszenia były natychmiast obecne w pamięci, co wskazuje, że tworzenie cLTM utrzymywało się przez długi czas bez rozpadu (ryc. 1f). W ten sposób cLTM powstaje w ciągu 3 minut po treningu, co sugeruje, że do jego powstania nie jest wymagana konsolidacja syntezy białek.

Ta zaskakująca obserwacja skłoniła nas do zbadania, czy cLTM różni się od tradycyjnego LTM, czy też stanowi to samo pamięć odzyskana w różnych kontekstach środowiskowych. Przedstawione poniżej liczne dowody sugerują, że cLTM jest odrębnym składnikiem pamięci o różnych cechach molekularnych i anatomicznych.

Neurony dopaminergiczne biorą udział w tworzeniu cLTM

Tworzenie LTM wymaga neuronów dopaminergicznych ( DAN), więc zbadaliśmy rolę DAN w kodowaniu cLTM, porównując 24-godzinną pamięć much kontrolnych z pamięcią much, których synaptyczne wyjścia z DAN zostały zablokowane podczas treningu. W tym celu ekspresja UAS-Shibirets1 (Shits) została skierowana do DAN poprzez TH-Gal4, tak że normalne wyjście synaptyczne było dozwolone w dopuszczalnych temperaturach (23 ° C), ale blokowane w restrykcyjnych temperaturach (32 ° C) 36. Aby zapewnić spójne warunki środowiskowe między treningiem a testami, przyjęliśmy rygorystyczny schemat obróbki termicznej. W szczególności, aby zablokować transmisję synaptyczną podczas treningu, muchy zostały przeniesione do środowiska 32 ° C 30 minut przed treningiem iz powrotem do 23 ° C bezpośrednio przed treningiem. Następnie ukończyli szkolenie w ciągu 5 minut i zostali przetestowani 24 godziny później w 23 ° C. W podanym oknie czasowym (5 min) transmisja synaptyczna neuronów wyrażających Shits pozostawała zablokowana (rysunek uzupełniający 2a). Podobnie w przypadku testów, które wymagały blokady neuronów podczas badania, muchy przed badaniem przenoszono do środowiska 32 ° C, ale były trenowane i testowane w temperaturze 23 ° C (ryc. 2a). Wyniki pokazały, że blokowanie uwalniania neuroprzekaźnika z neuronów znakowanych TH-Gal4 upośledza tworzenie cLTM, co sugeruje, że do kodowania cLTM potrzebne są DAN. Ten wniosek został dodatkowo poparty przez test behawioralny, który wykazał, że cLTM nie wystąpił u muszek mutanta receptora dopaminy D1 (dDA1) Drosophila (dDA1dumb2) 37 ani u much z paneuronalnym knockdownem dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb -Gal4) (ryc. 2b). Sugeruje to, że neuromodulacja pośredniczona przez dDA1 odgrywa rolę w nabywaniu cLTM.

Jednak dDA1 wyrażane w neuronach MB nie były zaangażowane w akwizycję cLTM, ponieważ ukierunkowana nadekspresja dDA1 w neuronach MB na zmutowanym tle dDA1dumb2 (dDA1dumb2; OK107-Gal4) nie uratowała nabycia cLTM. Zgodnie z tym knockdown dDA1 w neuronach MB (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) nie wpłynął na cLTM. Dane te sugerują, że cLTM jest kodowany przez neuromodulację, w której pośredniczy dDA1, ale nie w MB.

Pobieranie cLTM jest niezależne od neuronów ciała grzyba.

Co ciekawe, dDA1 w neuronach MB były nie bierze udziału w akwizycji cLTM, podczas gdy wszystkie wcześniejsze badania w tej dziedzinie wykazały, że tworzenie niezależnych od kontekstu, awersyjnych komponentów pamięci, w tym tradycyjnego LTM, obejmuje neurony MB38,39,40,41. Aby potwierdzić tę obserwację, zbadaliśmy rolę neuronów MB w odzyskiwaniu cLTM. W tym celu ekspresja UAS-Shits została nakierowana na neurony MB poprzez dwa niezależne sterowniki Gal4: OK107-Gal4 i C772-Gal4 (rysunek uzupełniający 2b, c). Chociaż odzyskanie LTM nie powiodło się w OK107-Gal4; UAS-Shits muchy (uzupełniający ryc. 2d), cLTM pozostał nienaruszony w OK107-Gal4; UAS-Shits i C772-Gal4; UAS-Shits leci (ryc. 2c, d), potwierdzając, że Neurony MB nie biorą udziału w tworzeniu lub odzyskiwaniu cLTM.

Pobieranie cLTM wymaga neuronów AL i projekcyjnych

Aby określić, które obszary mózgu są wymagane do pobrania cLTM, zbadaliśmy Lokalne neurony AL i neurony projekcyjne (PN). Informacje węchowe u much są przekazywane z neuronów czuciowych do neuronów AL i PN, które następnie rozwidlają się do MB i LH42. Najpierw przetestowaliśmy wpływ blokowania wyjścia synaptycznego z lokalnych neuronów AL oznaczonych przez OK66-Gal4 (rysunek uzupełniający 3a). Blokada transmisji synaptycznej w temperaturze restrykcyjnej zniosła cLTM w OK66-Gal4; Muchy UAS-Shits (ryc. 3a). Następnie przetestowaliśmy wpływ dwóch odrębnych podgrup neuronów projekcyjnych, z neuronami projekcyjnymi pobudzającymi (ePN) projekcyjnymi zarówno do MB, jak i LH, oznaczonych jako GH146-Gal4 (rysunek uzupełniający 3b), a neurony projekcyjne hamujące (iPN) region LH, oznaczony jako MZ699-Gal4 (rysunek uzupełniający 3c). 24-godzinne zwiększenie pamięci w obecności gridów nie było widoczne, gdy wyjście ePN lub iPN zostało zablokowane (rys. 3b, c). Te obserwacje pokazują, że neurony AL i PN uczestniczą w węchowym przesyłaniu informacji podczas pobierania cLTM, podobnie jak w przypadku wszystkich wcześniej zidentyfikowanych niezależnych od kontekstu komponentów pamięci. Natomiast sieci iPN oznaczone MZ699-Gal4, które wystają do LH, są wymagane do przyzwyczajenia węchowego, ale nie do odzyskiwania pamięci niezależnej od kontekstu28,43. Ten efekt MZ699-Gal4 sugeruje, że LH odgrywa rolę w odzyskiwaniu cLTM.

Pobieranie cLTM wymaga neuronów LH i AMMC

Co ciekawe, neurony LH są połączone z wieloma odległymi regionami mózgu25. Niedawne odkrycie donosi, że LH otrzymuje multisensoryczne sygnały wejściowe z obszarów mózgu różnych systemów sensorycznych44. Należą do nich antennalne centrum mechanosensoryczne i motoryczne (AMMC), które przekazuje informacje mechanosensoryczne, protocerebrum brzuszny boczny (vlpr), który jest odpowiedzialny za widzenie kolorów33, oraz inne obszary związane ze smakiem i temperaturą32,45.Postawiliśmy więc hipotezę, że takie zbieżne połączenia neuronalne pośredniczą w odzyskiwaniu cLTM przy użyciu wielu modalności sensorycznych.

Aby przetestować tę hipotezę, najpierw skupiliśmy się na podgrupie neuronów LH połączonych z AMMC. Ośrodek ten odbiera różne sygnały mechanosensoryczne z narządu Johnsona, w tym dotyk, słuch, propriocepcję i wykrywanie wiatru46,47,48,49. Następnie przekazuje te sygnały do innych regionów mózgu, w tym do LH25. Wzorzec ekspresji NP1004-Gal4 wizualizowano przez wybarwienie markera celu błonowego mCD8: GFP w NP1004-Gal4; UAS-mCD8: leci GFP (ryc. 4a, lewy panel). Rzeczywiście, neurony AMMC-LH znakowane przez NP1004-Gal4 i barwienie immunologiczne wykazały, że presynaptyczny marker syt :: GFP (połączenie eGFP i synaptotagminy białka pęcherzyka synaptycznego) jest wzbogacony w LH NP1004-Gal4; UAS-syt :: GFP leci (Rys. 4a, prawy panel), co sugeruje, że istnieją połączenia synaptyczne z AMMC do LH.

Wywołana szokiem cieplnym odwracalna blokada upośledzonej transmisji synaptycznej pobierania cLTM w NP1004-Gal4; Muchy UAS-Shits (ryc. 4b). Potwierdzając tę obserwację, blokada transmisji synaptycznej w neuronach AMMC wyznakowanych R38E07-Gal4 i NP0761-Gal4 również tłumiła pobieranie cLTM (ryc. 4c i uzupełniający ryc. 4c). Wyniki te sugerują, że reprezentacja informacji mechanosensorycznej w neuronach AMMC-LH ma kluczowe znaczenie dla pobierania cLTM. Aby dodatkowo potwierdzić ten wniosek, zablokowaliśmy mechanosensoryczne sygnały wejściowe poprzez usunięcie aristy, która jest głównym organem mechanosensorycznym u Drosophila, po treningu. Wyniki pokazały, że to leczenie osłabiło cLTM (ryc. 4d), ale nie miało wpływu na uczenie się (uzupełniający ryc. 4d), co sugeruje rolę neuronów AMMC-LH w cLTM.

Następnie zobrazowaliśmy odpowiedzi wapnia w koniec LH neuronów AMMC-LH po bodźcu mechanosensorycznym nałożonym małym pędzelkiem na arystę (patrz rozdział Metody). W tym celu dokonaliśmy ekspresji GCamP6f, wrażliwego na wapń białka fluorescencyjnego50, napędzanego przez NP1004-Gal4. Następnie zarejestrowaliśmy fluorescencję GCamP6f z regionów LH (Rys. 4e). Istniały mocne reakcje na kontakt aristy ze szczotką w regionie LH, potwierdzające pogląd, że informacje mechanosensoryczne są przekazywane do LH przez neurony AMMC-LH.

Aby potwierdzić, że te obserwacje były istotne behawioralnie, monitorowaliśmy Aktywność neuronalna AMMC z wykorzystaniem transkrypcyjnego reportera wewnątrzkomórkowego wapnia (TRIC) 51, który zwiększa ekspresję GFP proporcjonalnie do wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia u much. Fluorescencję TRIC z regionu AMMC obliczono 3 godziny po odzyskaniu i znormalizowano względem much kontrolnych (ryc. 4f). Znacząco większy sygnał TRIC zaobserwowano w AMMC po pobraniu zależnym od kontekstu niż u much kontrolnych lub po pobraniu niezależnym od kontekstu, co pokazuje, że aktywność neuronalna AMMC dobrze koreluje z pobieraniem zależnym od kontekstu. Zatem neurony LH są zdolne do integrowania informacji mechanosensorycznej z AMMC i informacji węchowych z AL w celu pobrania cLTM (ryc. 4g).

Integracja multisensoryczna w LH leży u podstaw pobierania cLTM

Następnie sprawdziliśmy dalej, czy inne systemy sensoryczne również były zaangażowane w ten proces, takie jak system wzrokowy. Zablokowaliśmy wizualne dane wejściowe poprzez ukierunkowaną ekspresję wrażliwych na temperaturę mutantów Shits w oczach (UAS-Shits; GMR-Gal4) i neuronach płata wzrokowego (UAS-Shits; R82D10-Gal4) podczas pobierania cLTM (rysunek uzupełniający 6a). cLTM zostały zniesione w obu przypadkach, co sugeruje, że system wzrokowy jest również zaangażowany w odzyskiwanie cLTM.

Taki bodziec wzrokowy, jak również inne potencjalne bodźce czuciowe, rzekomo zbiega się do neuronów LH, tak jak w przypadku Wejście. Przeprowadziliśmy ukierunkowaną ekspresję markera presynaptycznego syt :: GFP w dostępnych liniach Gal4, znakując następujące neurony LH, górny środkowy protocerebrum do LH (smpr-LH; MZ671-Gal4), górny boczny protocerebrum (odpowiedni dla smaku52) do LH (slpr -LH; NP3060-Gal4) i protocerebrum brzuszno-bocznego przyśrodkowego (istotne dla widzenia33) do LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. Wyniki pokazały, że projekcje z wybranych regionów mózgu gromadzą się lub tworzą synapsy w regionie LH (ryc. 5a), co sugeruje, że różne informacje kontekstowe są przekazywane do LH.

Następnie przetestowaliśmy wpływ manipulacji znakowanymi neuronami na pobieranie cLTM. Blokowanie transmisji synaptycznej każdej podgrupy neuronów LH zniosło pobieranie cLTM (ryc. 5b i uzupełniający ryc. 5). Jednak na pobieranie cLTM nie wpłynęła blokada neuronów wyjściowych MB (MB-V2, oznaczonych przez NP2492-Gal4), które rzutują do LH, co zostało zgłoszone jako wymagane dla tradycyjnego LTM53. To połączenie może być konieczne do odzyskania niezależnej od kontekstu awersyjnej pamięci węchowej53,54. Zatem odzyskiwanie cLTM obejmuje również integrację sygnałów synaptycznych z innych odrębnych obszarów czuciowych mózgu do LH (ryc. 5c).

Aby określić, czy te neurony LH są również zaangażowane w odzyskiwanie tradycyjnego LTM, zablokowaliśmy te neurony podczas pobierania po treningu z przerwami. Taka blokada nie wywarła wpływu na LTM (ryc. Uzupełniający 5b).

Aby dodatkowo zweryfikować rolę neuronów LH w odzyskiwaniu cLTM, przetestowaliśmy efekty blokowania neuronów wyjściowych LH. Zidentyfikowano szereg szczepów Gal4, aby wyznakować neurony wyjściowe LH44. 24-godzinny cLTM nie był widoczny, gdy sygnał wyjściowy z neuronów wyznakowanych przez PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 lub AV6b1 był zablokowany (rysunek uzupełniający 5c), podczas gdy AD1e1 i AV6a1 nie były. Te obserwacje pokazują, że LH odgrywa centralną rolę w odzyskiwaniu cLTM.

Biorąc pod uwagę przedstawione dane wraz z raportowanym badaniem komponentów pamięci niezależnych od kontekstu, jesteśmy skłonni zaproponować model dla odzyskiwania cLTM i LTM (ryc. 6). Integracja multisensoryczna w bramkach LH umożliwia odzyskanie cLTM, podczas gdy sam kondycjonowany zapach jest wystarczający do odzyskania pamięci niezależnych od kontekstu.