Herstel van het koperen rooster naar de testbuis onthult cLTM

Alle voorgaande publicaties waarbij aversieve olfactorische conditionering in Drosophila betrokken is, hebben gedragstestapparatuur en -procedures gebruikt die zijn afgeleid van hetzelfde ontwerpprincipe. Dat wil zeggen, de vliegen worden getraind in een oefenbuis met een koperen roosteroppervlak dat elektrische schokken afgeeft (Fig. 1a, linkerpaneel) en getest in testbuizen zonder het koperen rooster (Fig. 1a, middenpaneel). Dus in geen enkele eerdere studies was het ophalen van aversieve geheugencomponenten de aanwezigheid van het koperen rooster vereist. Toen het koperen rooster werd hersteld naar de testbuizen (Fig. 1a, rechterpaneel) – een procedure die de geurscherpte niet beïnvloedt (aanvullende tab. 1) of leidt tot valse geheugenprestaties (aanvullende afbeelding 1a), onthulde de gedragstest opvallende effecten. Eenmalige conditionering produceerde een koperen netafhankelijke geheugencomponent die langer volhield dan eerder gezien werd, zelfs in uit elkaar geplaatste, herhaalde proeven. Concreet duurde het geheugen ten minste 14 dagen, wat de langste geteste periode was (Fig. 1b).

Om te bepalen of deze koperen roosterafhankelijke geheugenverbetering de algemene effecten van contextherstel weerspiegelt, hebben we geprobeerd andere elementen van de trainingsomgeving te veranderen, met name de kleur van het omgevingslicht en de omgevingstemperatuur als vliegen kunnen op beide reageren32,33. Toen het rode trainingslicht tijdens het testen naar geel werd geschakeld, of vice versa, vond geen geheugenverbetering plaats, zelfs niet wanneer het koperen rooster was voorzien (figuur 1c en aanvullende figuur 1c). Evenzo verdween de verbetering wanneer de testtemperatuur duidelijk verschilde van de leertemperatuur (23 ° C versus 32 ° C, of vice versa; Fig. 1c en aanvullende Fig. 1d). Daarom blokkeerde het wijzigen van een omgevingsconditie van de coderingscontext het koperen netwerkafhankelijke geheugen volledig.

Het verschil tussen de coderingsomgeving en de testomgeving moest echter voldoende significant of gemakkelijk te detecteren zijn om het ophalen van het kopernetafhankelijke geheugen. Geheugenverbetering werd bijvoorbeeld behouden wanneer de testtemperatuur werd gewijzigd van een coderingstemperatuur van 23 ° C naar een testtemperatuur van 25 ° C (aanvullende afbeelding 1e).

In ieder geval het ophalen van koper grid-afhankelijk geheugen vereist geconditioneerde geur en volledig herstel van de coderende omgevingscontext. Daarom noemden we deze geheugencomponent contextafhankelijke LTM (cLTM).

cLTM vereist geen eiwitsynthese-afhankelijke consolidatie

Aangezien de meeste onderzoeken alleen LTM hebben uitgelokt met behulp van trainingsprotocollen met tussenruimte , en omdat LTM afhangt van eiwitsynthese3, hebben we verder bepaald of eiwitsynthese-afhankelijke consolidatie noodzakelijk is voor cLTM.Opmerkelijk was dat de vorming van een dergelijk langdurig geheugen onafhankelijk was van de eiwitsynthese, omdat toediening van cycloheximide (CXM), een remmer van de eiwitsynthese, geen invloed had op de vorming van cLTM (Fig. 1d), terwijl dezelfde behandeling LTM-vorming blokkeerde (aanvullend Fig. . 1f), zoals verwacht3,8,9. Ter ondersteuning van deze waarneming vertoonde remming van eiwitsynthese door pan-neuronale expressie van RICIN34, een eiwit inactiverende eukaryote ribosomen, in transgene vliegen (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) ook geen effect op cLTM-vorming (aanvullend Fig. 1g). We bevestigden een dergelijke onafhankelijkheid verder door pan-neuronale expressie (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) van een repressor-isovorm van cAMP-responselement-bindend proteïne 2 (CREB2b) waarvan wordt gemeld dat het LTM5 blokkeert in transgene vliegen had geen invloed op cLTM ( Afb. 1g). Bovendien voerden klassieke leer- en geheugen-rutabaga (rut) -mutanten, rut1 en rut2080, met verzwakte cAMP-synthese een normale cLTM uit (figuur 1h). De gepresenteerde gegevens suggereren dus sterk dat cLTM-vorming geen eiwitsynthese vereist en daarom verschilt van de contextonafhankelijke LTM. cLTM is ook te onderscheiden van anesthesie-resistent geheugen (ARM) omdat het normaal blijft in een radijsmutant (aanvullend figuur 1h) terwijl ARM verzwakt is35.

Om deze verrassende bevindingen te valideren, hebben we bepaald of de vorming van cLTM kost tijd, nog een indicatie van consolidatie. Daartoe hebben we de weerstand van cLTM tegen koudeschokbehandeling gekarakteriseerd, waarvan bekend is dat het korte- en middellangetermijngeheugen afschaft3,8. Vierentwintig uur na de training bleef cLTM onaangetast (Fig. 1d) door een typische koudeschokbehandeling. Dergelijke koude-schokbestendigheid stelde ons in staat om twee vervolgexperimenten uit te voeren:

Ten eerste pasten we een koude-schokbehandeling toe gedurende 2 minuten onmiddellijk na één conditioneringsproef. Na 3 minuten rust van de koude schok, toonde een gedragstest aan dat de koude-schokbestendige cLTM al op volle sterkte was gevormd (ongeveer 20% van de prestatie-index; Fig. 1e). Ten tweede hebben we, om de waarneming verder te valideren, de sterkte van de elektrische trainingsschok teruggebracht van 60 naar 20 V om plafondeffecten van geheugensterkte te vermijden. We ontdekten dat, zelfs bij zo’n zwakke trainingskracht, cLTM onmiddellijk werd gevormd, omdat vergelijkbare verbeteringen onmiddellijk in het geheugen aanwezig waren, wat aangeeft dat cLTM-vorming lange tijd aanhield zonder te vervallen (Fig. 1f). Dus cLTM wordt gevormd binnen 3 minuten na training, wat suggereert dat er geen consolidatie van eiwitsynthese nodig is voor de vorming ervan.

Deze verrassende observatie zette ons ertoe aan te onderzoeken of cLTM verschilt van traditionele LTM of slechts hetzelfde is geheugen opgehaald in verschillende omgevingscontexten. Meerdere bewijzen, hieronder weergegeven, suggereerden dat cLTM een aparte geheugencomponent is met verschillende moleculaire en anatomische kenmerken.

Dopaminerge neuronen zijn betrokken bij cLTM-vorming

LTM-vorming vereist dopaminerge neuronen ( DAN’s), dus onderzochten we de rol van DAN’s bij cLTM-codering, waarbij we 24-uurs geheugen in controlevliegen vergeleken met dat in vliegen waarvan de synaptische output van DAN’s tijdens de training werd geblokkeerd. Voor dit doel werd expressie van UAS-Shibirets1 (Shits) gericht op DAN’s via TH-Gal4, zodat normale synaptische output was toegestaan bij toegestane temperaturen (23 ° C) maar geblokkeerd bij beperkende temperaturen (32 ° C) 36. Om consistente omgevingscondities tussen training en testen te garanderen, hebben we een strikt regime voor temperatuurbehandelingen aangenomen. Specifiek, om synaptische transmissie tijdens de training te blokkeren, werden vliegen 30 minuten voor de training naar een 32 ° C-omgeving verplaatst en onmiddellijk voor de training terug naar 23 ° C. Ze voltooiden vervolgens de training binnen 5 minuten en werden 24 uur later getest bij 23 ° C. Binnen het gegeven tijdvenster (5 minuten) bleef de synaptische transmissie van neuronen die Shits tot expressie brengen geblokkeerd (aanvullende figuur 2a). Evenzo werden in het geval van assays die neuronblokkade vereisten tijdens het testen, vliegen verplaatst naar een 32 ° C-omgeving voordat ze werden getest, maar werden ze getraind en getest bij 23 ° C (Fig. 2a). De resultaten toonden aan dat het blokkeren van de afgifte van neurotransmitters uit TH-Gal4-gelabelde neuronen de vorming van cLTM verstoorde, wat suggereert dat DAN’s nodig zijn voor cLTM-codering. Deze conclusie werd verder ondersteund door de gedragstest, waaruit bleek dat er geen cLTM voorkwam in de Drosophila D1 dopaminereceptor (dDA1) -mutant vliegen (dDA1dumb2) 37 of in vliegen met pan-neuronale knockdown van dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb -Gal4) (Afb. 2b). Dit suggereert dat dDA1-gemedieerde neuromodulatie een rol speelt bij cLTM-acquisitie.

DDA1’s die tot expressie werden gebracht in MB-neuronen waren echter niet betrokken bij cLTM-acquisitie, omdat gerichte overexpressie van dDA1 in MB-neuronen op een dDA1dumb2-mutante achtergrond (dDA1dumb2; OK107-Gal4) de cLTM-acquisitie niet kon redden. In overeenstemming hiermee had dDA1-knockdown in MB-neuronen (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) geen invloed op cLTM. Deze gegevens suggereren dat cLTM wordt gecodeerd door dDA1-gemedieerde neuromodulatie, maar niet in de MB.

Het ophalen van cLTM is onafhankelijk van neuronen uit het paddenstoellichaam

Interessant is dat dDA1’s in MB-neuronen niet betrokken bij cLTM-acquisitie, terwijl alle eerdere studies op dit gebied hebben aangetoond dat bij de vorming van contextonafhankelijke, aversieve geheugencomponenten, inclusief traditionele LTM, MB-neuronen betrokken zijn38,39,40,41. Om deze observatie te bevestigen, onderzochten we de rol van MB-neuronen bij het ophalen van cLTM. Daartoe was de expressie van UAS-Shits gericht op MB-neuronen via twee onafhankelijke Gal4-stuurprogramma’s: OK107-Gal4 en C772-Gal4 (aanvullende figuur 2b, c). Hoewel het ophalen van LTM mislukte in OK107-Gal4; UAS-Shits-vliegen (aanvullende figuur 2d), bleef cLTM intact in OK107-Gal4; UAS-Shits en C772-Gal4; UAS-Shits-vliegen (figuur 2c, d), wat bevestigt dat MB-neuronen zijn niet betrokken bij de vorming of het ophalen van cLTM.

Voor het ophalen van cLTM zijn AL- en projectie-neuronen nodig

Om te bepalen welke hersengebieden nodig zijn voor cLTM-retrieval, hebben we de rol van AL lokale neuronen en projectie-neuronen (PN’s). Olfactorische informatie in vliegen wordt doorgegeven van sensorische neuronen naar AL-neuronen en PN’s, die vervolgens splitsen naar de MB en LH42. We hebben eerst de effecten getest van het blokkeren van de synaptische output van AL lokale neuronen gelabeld met OK66-Gal4 (aanvullende figuur 3a). Blokkade van synaptische transmissie bij restrictieve temperatuur maakte een einde aan cLTM in OK66-Gal4; UAS-Shits-vliegen (Fig. 3a). Vervolgens hebben we de effecten getest van twee verschillende subgroepen van projectie-neuronen, waarbij exciterende projectie-neuronen (ePN’s) projecteren naar zowel de MB als de LH, gelabeld door GH146-Gal4 (aanvullende figuur 3b), en remmende projectie-neuronen (iPN’s) die alleen projecteren op het LH-gebied, gelabeld door MZ699-Gal4 (aanvullende figuur 3c). De 24-uurs geheugenverbetering in de aanwezigheid van grids was niet duidelijk wanneer de uitvoer van ePN’s of iPN’s werd geblokkeerd (Fig. 3b, c). Deze waarnemingen tonen aan dat AL-neuronen en PN’s deelnemen aan olfactorische informatieoverdracht tijdens het ophalen van cLTM, net als bij alle eerder geïdentificeerde contextonafhankelijke geheugencomponenten. Daarentegen zijn iPN’s gelabeld met MZ699-Gal4, die naar de LH projecteren, vereist voor olfactorische gewenning, maar niet voor het ophalen van contextonafhankelijk geheugen. Dit effect van MZ699-Gal4 impliceert dat de LH een rol speelt bij het ophalen van cLTM.

Het ophalen van cLTM vereist LH- en AMMC-neuronen

Interessant is dat LH-neuronen verbonden zijn met meerdere afgelegen hersengebieden25. Een recente ontdekking meldt dat de LH multisensorische input ontvangt van hersengebieden van verschillende sensorische systemen44. Deze omvatten het antennale mechanosensorische en motorische centrum (AMMC), dat mechanosensorische informatie communiceert, het ventrale laterale protocerebrum (vlpr), dat verantwoordelijk is voor kleurwaarneming33, en andere gebieden die betrokken zijn bij smaak en temperatuur32,45.We veronderstelden dus dat dergelijke convergerende neuronale verbindingen cLTM-retrieval mediëren met behulp van meerdere sensorische modaliteiten.

Om deze hypothese te testen, hebben we ons eerst gericht op een subgroep van LH-neuronen die zijn gekoppeld aan het AMMC. Dit centrum ontvangt diverse mechanosensorische signalen van het orgel van Johnson, waaronder aanraking, gehoor, proprioceptie en windwaarneming46,47,48,49. Het geeft deze signalen vervolgens door aan andere hersenregio’s, waaronder de LH25. Het expressiepatroon van NP1004-Gal4 werd zichtbaar gemaakt door kleuring van de membraandoelmarker mCD8: GFP in NP1004-Gal4; UAS-mCD8: GFP-vliegen (Fig. 4a, linkerpaneel). AMMC-LH-neuronen gelabeld met NP1004-Gal4 en immunokleuring toonden inderdaad aan dat het presynaptische marker syt :: GFP (een fusie van eGFP en het synaptische vesikeleiwit synaptotagmine) verrijkt is binnen de LH van NP1004-Gal4; UAS-syt :: GFP vliegt (Fig. 4a, rechter paneel), wat suggereert dat er synaptische verbindingen zijn van de AMMC naar de LH.

Door hitteschok geïnduceerde omkeerbare blokkade van synaptische transmissie gestoorde cLTM-retrieval in NP1004-Gal4; UAS-Shits-vliegen (Fig. 4b). Bevestigend deze waarneming, blokkade van synaptische transmissie in AMMC-neuronen gelabeld met R38E07-Gal4 en NP0761-Gal4 onderdrukte ook het ophalen van cLTM (figuur 4c en aanvullende figuur 4c). Deze resultaten suggereren dat de weergave van mechanosensorische informatie binnen AMMC-LH-neuronen cruciaal is voor het ophalen van cLTM. Om deze conclusie verder te bevestigen, hebben we mechanosensorische inputs geblokkeerd door na training arista, een belangrijk mechanosensorisch orgaan in Drosophila, te verwijderen. De resultaten toonden aan dat deze behandeling cLTM verstoorde (Fig. 4d) maar geen invloed had op het leren (aanvullende Fig. 4d), wat duidt op een rol voor AMMC-LH-neuronen in cLTM.

Vervolgens hebben we calciumresponsen in beeld gebracht in de LH-terminal van AMMC-LH-neuronen na mechanosensorische stimulus die met een klein penseel op de arista is aangebracht (zie sectie Methoden). Daartoe brachten we GCamP6f tot expressie, een calciumgevoelig fluorescerend proteïne50, aangedreven door NP1004-Gal4. Vervolgens hebben we de fluorescentie van GCamP6f uit de LH-regio’s geregistreerd (Fig. 4e). Er waren robuuste reacties op arista-contact met de borstel in het LH-gebied, wat het idee ondersteunt dat mechanosensorische informatie wordt doorgegeven aan de LH via AMMC-LH-neuronen.

Om te bevestigen dat deze waarnemingen gedragsmatig significant waren, hebben we gecontroleerd AMMC-neuronale activiteit met behulp van de transcriptionele reporter van intracellulair calcium (TRIC) 51, die de GFP-expressie verhoogt in verhouding tot de intracellulaire calciumspiegels bij vliegen. De fluorescentie van TRIC uit het AMMC-gebied werd 3 uur na het ophalen berekend en genormaliseerd om vliegen te controleren (Fig. 4f). Significant groter TRIC-signaal werd waargenomen in het AMMC na contextafhankelijk ophalen dan in de controlevliegen of na contextonafhankelijk ophalen, wat aantoont dat AMMC-neuronale activiteit goed correleert met contextafhankelijk ophalen. LH-neuronen zijn dus in staat mechanosensorische informatie van de AMMC en olfactorische informatie van de AL te integreren om cLTM op te halen (Fig. 4g).

Multisensorische integratie in de LH ligt ten grondslag aan cLTM-retrieval

Vervolgens hebben we verder geverifieerd of andere sensorische systemen ook bij dit proces betrokken waren, zoals het visuele systeem. We blokkeerden visuele input door gerichte expressie van temperatuurgevoelige mutant Shits in ogen (UAS-Shits; GMR-Gal4) en de optische lobneuronen (UAS-Shits; R82D10-Gal4) tijdens cLTM-retrieval (aanvullende figuur 6a). cLTM werd in beide gevallen afgeschaft, wat suggereert dat het visuele systeem ook betrokken is bij het ophalen van cLTM.

Dergelijke visuele input en andere potentiële sensorische inputs convergeren zogenaamd naar LH-neuronen, net als in het geval van mechanosensorische invoer. We voerden gerichte expressie uit van het presynaptische marker syt :: GFP in beschikbare Gal4-lijnen, waarbij we de volgende LH-neuronen labelden, superieur mediaal protocerebrum naar LH (smpr-LH; MZ671-Gal4), superieur lateraal protocerebrum (relevant voor smaak52) naar LH (slpr -LH; NP3060-Gal4), en ventraal lateraal mediaal protocerebrum (relevant voor visueel33) tot LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. De resultaten toonden aan dat projecties van gerichte hersenregio’s samenkomen of synapsen maken in de LH-regio (Fig. 5a), wat suggereert dat diverse contextuele informatie wordt doorgegeven aan de LH.

Vervolgens hebben we de effecten getest van het manipuleren van de gelabelde neuronen op het ophalen van cLTM. Het blokkeren van synaptische transmissie van elke subgroep van LH-neuronen maakte een einde aan het ophalen van cLTM (figuur 5b en aanvullende figuur 5). Het ophalen van cLTM werd echter niet beïnvloed door blokkade van MB-outputneuronen (MB-V2, gelabeld door NP2492-Gal4) die naar de LH projecteren, wat volgens de traditionele LTM53 vereist was. Deze verbinding kan nodig zijn voor het ophalen van contextonafhankelijk aversief olfactorisch geheugen53,54. Dus, cLTM-retrieval omvat ook de integratie van synaptische inputs van andere verschillende sensorische hersenregio’s naar de LH (Fig. 5c).

Om te bepalen of deze LH-neuronen ook betrokken zijn bij het ophalen van de traditionele LTM, hebben we geblokkeerd deze neuronen tijdens het ophalen na training op afstand. Een dergelijke blokkade had geen invloed op LTM (aanvullend figuur 5b).

Om een rol van LH-neuronen bij het terughalen van cLTM verder te valideren, hebben we vervolgens de effecten van het blokkeren van LH-outputneuronen getest. Een aantal Gal4-stammen wordt geïdentificeerd om LH-outputneuronen te labelen44. De 24-h cLTM was niet duidelijk wanneer de output van neuronen gelabeld met PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 of AV6b1 was geblokkeerd (aanvullende figuur 5c), terwijl AD1e1 en AV6a1 dat niet waren. Deze waarnemingen tonen aan dat LH een centrale rol speelt bij het ophalen van cLTM.

Op basis van de gepresenteerde gegevens samen met de gerapporteerde studie van contextonafhankelijke geheugencomponenten, wordt ons ertoe gebracht een model voor te stellen voor het ophalen van cLTM en LTM (Fig. 6). Multisensorische integratie in de LH-poorten de terughaalbaarheid van cLTM terwijl alleen geconditioneerde geur voldoende is voor het terughalen van contextonafhankelijke herinneringen.