구리 그리드를 테스트 튜브로 복원하면 cLTM이 나타납니다.

모든 이전 출판물 Drosophila에서 혐오적인 후각 조절을 포함하는 것은 동일한 설계 원칙에서 파생 된 행동 분석 장치 및 절차를 사용했습니다 10. 즉, 파리는 전기 충격을 전달하는 구리 그리드 표면이있는 훈련 튜브 (그림 1a, 왼쪽 패널)에서 훈련되고 구리 그리드가없는 테스트 튜브에서 테스트됩니다 (그림 1a, 중간 패널). 따라서 이전 연구에서 구리 그리드의 존재를 요구하는 혐오 메모리 구성 요소를 검색하지 않았습니다. 구리 그리드가 테스트 튜브로 복원되었을 때 (그림 1a, 오른쪽 패널)-냄새 예민 (보충 표 1)에 영향을주지 않거나 잘못된 기억 성능 (보조 그림 1a)을 유발하지 않는 절차, 행동 분석 결과가 밝혀졌습니다. 눈에 띄는 효과. 단일 시험 컨디셔닝은 간격을두고 반복 된 시험에서도 이전에 보았던 것보다 오래 지속되는 구리 그리드 의존 메모리 구성 요소를 생성했습니다. 특히 메모리는 최소 14 일 동안 지속되었으며, 이는 테스트 된 가장 긴 기간이었습니다 (그림 1b).

이 구리 그리드 의존 메모리 향상이 컨텍스트 복원의 일반적인 효과를 반영하는지 확인하기 위해, 우리는 훈련 환경의 다른 요소, 특히 주변 빛의 색상과 파리의 환경 온도를 변경하려고했습니다. 모두 32,33에 응답 할 수 있습니다. 테스트에서 빨간색 훈련 표시등이 노란색으로 전환되거나 그 반대의 경우 구리 그리드가 제공 되었더라도 메모리 향상이 발생하지 않았습니다 (그림 1c 및 보충 그림 1c). 유사하게, 테스트 온도가 학습 온도와 현저하게 다를 때 향상이 사라졌습니다 (23 ° C 대 32 ° C 또는 그 반대; 그림 1c 및 보충 그림 1d). 따라서 인코딩 컨텍스트의 환경 조건을 변경하면 구리 그리드 종속 메모리가 완전히 차단되었습니다.

그러나 인코딩 환경과 테스트 환경 간의 차이는 검색에 영향을 미칠만큼 충분히 중요하거나 쉽게 감지 할 수 있어야합니다. 구리 그리드 종속 메모리. 예를 들어, 테스트 온도가 인코딩 온도 23 ° C에서 테스트 온도 25 ° C로 변경 될 때 메모리 향상이 보존되었습니다 (보조 그림 1e).

어쨌든 구리 검색 그리드 의존적 메모리는 조절 된 냄새와 인코딩 환경 컨텍스트의 완전한 복원을 필요로합니다. 이것이 우리가이 기억 요소를 상황 의존적 LTM (cLTM)이라고 부르는 이유입니다.

cLTM은 단백질 합성 의존적 통합을 필요로하지 않습니다.

대부분의 연구에서는 간격 훈련 프로토콜을 사용하여 LTM 만 유도했기 때문에 , LTM이 단백질 합성에 의존하기 때문에 cLTM에 단백질 합성 의존적 통합이 필요한지 여부를 추가로 결정했습니다.놀랍게도, 이러한 오래 지속되는 기억의 형성은 단백질 합성 억제제 인 시클로 헥시 미드 (CXM)의 투여가 cLTM 형성에 영향을 미치지 않았기 때문에 (그림 1d) 동일한 치료가 LTM 형성을 차단했기 때문에 단백질 합성과 무관했습니다 (보충 그림 . 1f), 예상대로 3,8,9. 이 관찰을 뒷받침하기 위해 형질 전환 파리 (UAS-RICIN; nSyb-Gal4)에서 진핵 리보솜을 비활성화시키는 단백질 인 RICIN34의 범 신경 세포 발현을 통한 단백질 합성 억제는 cLTM 형성에도 영향을 미치지 않았습니다 (보조 그림 1g). 우리는 트랜스 제닉 파리에서 LTM5를 차단하는 것으로보고 된 cAMP- 반응 요소 결합 단백질 2 (CREB2b)의 억제 자 이소 폼의 범 신경 세포 발현 (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4)을 통해 이러한 독립성을 추가로 확인했습니다. 그림 1g). 더욱이, 고전적 학습 및 기억 rutabaga (rut) 돌연변이 체, rut1 및 rut2080, 감쇠 된 cAMP 합성은 정상 cLTM을 수행했다 (그림 1h). 따라서 제시된 데이터는 cLTM 형성이 단백질 합성을 필요로하지 않으므로 문맥 독립적 LTM과 다르다는 것을 강력하게 시사합니다. cLTM은 ARM이 손상된 반면 무 돌연변이 (보조 그림 1h)에서는 정상 상태를 유지하기 때문에 마취 저항성 기억 (ARM)과 구별됩니다 35.

이러한 놀라운 결과를 검증하기 위해 우리는 cLTM은 통합의 또 다른 지표 인 시간이 걸립니다. 이를 위해 우리는 단기 및 중기 기억을 폐지하는 것으로 알려진 저온 충격 치료에 대한 cLTM의 내성을 특성화했습니다 3,8. 훈련 24 시간 후, cLTM은 전형적인 냉 충격 치료의 영향을받지 않았습니다 (그림 1d). 이러한 내한 충격성 덕분에 두 가지 후속 실험을 수행 할 수있었습니다.

첫 번째로 한 번의 컨디셔닝 실험 직후 2 분 동안 냉 충격 치료를 적용했습니다. 콜드 쇼크에서 3 분간 휴식을 취한 후, 행동 분석 결과 콜드 쇼크 저항성 cLTM이 이미 최대 강도로 형성되었음을 보여주었습니다 (수행 지수의 약 20 %, 그림 1e). 둘째, 관찰을 추가로 검증하기 위해 훈련 전기 충격의 강도를 60V에서 20V로 줄여 메모리 강도의 천장 효과를 방지했습니다. 우리는 그러한 약한 훈련 강도에서도 유사한 향상이 즉시 기억에 존재하기 때문에 cLTM이 즉시 형성된다는 것을 발견했습니다. 이는 cLTM 형성이 쇠퇴하지 않고 오랫동안 지속되었음을 나타냅니다 (그림 1f). 따라서 훈련 후 3 분 이내에 cLTM이 형성되며, 이는 그 형성을 위해 단백질 합성 통합이 필요하지 않음을 시사합니다.

이 놀라운 관찰은 cLTM이 기존 LTM과 다른지 또는 단순히 동일한 구성인지 조사하도록 유도했습니다. 다른 환경 적 맥락에서 검색된 메모리. 아래에 제시된 여러 증거에 따르면 cLTM은 서로 다른 분자 및 해부학 적 특징을 가진 별개의 기억 구성 요소임을 시사합니다.

도파민 성 뉴런은 cLTM 형성에 관여합니다.

LTM 형성에는 도파민 성 뉴런이 필요합니다 ( 그래서 우리는 cLTM 인코딩에서 DAN의 역할을 조사하여 제어 파리의 24 시간 메모리를 훈련 중에 DAN의 시냅스 출력이 차단 된 파리의 메모리와 비교했습니다. 이를 위해 UAS-Shibirets1 (Shits)의 발현은 TH-Gal4를 통해 DAN을 표적으로 삼았으므로 정상적인 시냅스 출력은 허용 온도 (23 ° C)에서 허용되었지만 제한 온도 (32 ° C)에서는 차단되었습니다. 훈련과 테스트 사이에 일관된 환경 조건을 보장하기 위해 엄격한 온도 치료 요법을 채택했습니다. 특히 훈련 중 시냅스 전달을 차단하기 위해 파리를 훈련 30 분 전에 32 ° C 환경으로 이동하고 훈련 직전에 23 ° C로 다시 이동했습니다. 그런 다음 5 분 이내에 훈련을 완료하고 24 시간 후에 23 ° C에서 테스트했습니다. 주어진 시간 창 (5 분) 내에서 Shits를 표현하는 뉴런의 시냅스 전달은 차단 된 상태로 유지되었습니다 (보조 그림 2a). 유사하게, 테스트 중 뉴런 차단이 필요한 분석의 경우, 파리는 테스트 전에 32 ° C 환경으로 이동했지만 23 ° C에서 훈련 및 테스트되었습니다 (그림 2a). 결과는 TH-Gal4 표지 된 뉴런에서 신경 전달 물질의 방출을 차단하는 것이 cLTM 형성을 손상 시켰으며, 이는 DAN이 cLTM 인코딩에 필요함을 시사합니다. 이 결론은 Drosophila D1 도파민 수용체 (dDA1)-돌연변이 파리 (dDA1dumb2) 37 또는 dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb)의 범 신경 녹다운이있는 파리에서 cLTM이 발생하지 않았 음을 보여주는 행동 분석에 의해 더욱 뒷받침되었습니다. -Gal4) (그림 2b). 이는 dDA1 매개 신경 조절이 cLTM 획득에 중요한 역할을한다는 것을 의미합니다.

그러나, MB 뉴런에서 발현 된 dDA1은 cLTM 획득에 관여하지 않았습니다. dDA1dumb2 돌연변이 배경 (dDA1dumb2; OK107-Gal4)의 MB 뉴런에서 dDA1의 표적 과발현이 cLTM 획득을 구제하지 못했기 때문입니다. 이와 일치하여 MB 뉴런 (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi)의 dDA1 녹다운은 cLTM에 영향을 미치지 않았습니다. 이 데이터는 cLTM이 dDA1 매개 신경 조절에 의해 인코딩되지만 MB에서는 인코딩되지 않음을 시사합니다.

cLTM의 검색은 버섯 체 뉴런과 무관합니다.

흥미롭게도 MB 뉴런의 dDA1은 이 분야의 모든 이전 연구에 따르면 기존 LTM을 포함한 상황 독립적이고 혐오적인 기억 구성 요소의 형성에는 MB 뉴런이 포함된다는 사실이 밝혀졌습니다 38,39,40,41. 이 관찰을 확인하기 위해 cLTM 검색에서 MB 뉴런의 역할을 조사했습니다. 이를 위해 UAS-Shits의 발현은 두 개의 독립적 Gal4 드라이버 인 OK107-Gal4 및 C772-Gal4를 통해 MB 뉴런을 대상으로했습니다 (보조 그림 2b, c). LTM 검색은 OK107-Gal4; UAS-Shits 파리 (보조 그림 2d)에서 실패했지만 cLTM은 OK107-Gal4; UAS-Shits 및 C772-Gal4; UAS-Shits 파리 (그림 2c, d)에서 그대로 유지되었습니다. MB 뉴런은 cLTM의 형성 또는 검색에 관여하지 않습니다.

cLTM을 검색하려면 AL 및 투영 뉴런이 필요합니다.

cLTM 검색에 필요한 뇌 영역을 식별하기 위해 우리는 다음의 역할을 조사했습니다. AL 국소 뉴런 및 투영 뉴런 (PN). 파리의 후각 정보는 감각 뉴런에서 AL 뉴런과 PN으로 전달되어 MB와 LH42로 분기됩니다. 우리는 먼저 OK66-Gal4 (보조 그림 3a)로 표시된 AL 국소 뉴런에서 시냅스 출력을 차단하는 효과를 테스트했습니다. 제한 온도에서 시냅스 전달의 차단은 OK66-Gal4에서 cLTM을 폐지했습니다. UAS-Shits가 날아갑니다 (그림 3a). 그런 다음 GH146-Gal4 (보충 그림 3b)로 표시된 MB와 LH 모두에 투영되는 흥분성 투영 뉴런 (ePN)과 다음으로 만 투영되는 억제 투영 뉴런 (iPN)을 사용하여 투영 뉴런의 두 개의 별개 하위 그룹의 효과를 테스트했습니다. MZ699-Gal4 (보조 그림 3c)로 표시된 LH 영역. 그리드가있을 때 24 시간 메모리 향상은 ePN 또는 iPN의 출력이 차단되었을 때 분명하지 않았습니다 (그림 3b, c). 이러한 관찰은 AL 뉴런과 PN이 이전에 확인 된 모든 컨텍스트 독립적 메모리 구성 요소와 마찬가지로 cLTM 검색 중에 후각 정보 전송에 참여한다는 것을 보여줍니다. 대조적으로, LH에 투사되는 MZ699-Gal4로 표시된 iPN은 후각 습관화에 필요하지만 상황 독립적 기억의 검색은 필요하지 않습니다 28,43. MZ699-Gal4의 이러한 효과는 LH가 cLTM 검색에서 역할을한다는 것을 의미합니다.

cLTM을 검색하려면 LH 및 AMMC 뉴런이 필요합니다.

흥미롭게도 LH 뉴런은 여러 원격 뇌 영역에 연결되어 있습니다 25. 최근 발견에 따르면 LH는 다양한 감각 시스템의 뇌 영역에서 다중 감각 입력을 수신합니다 44. 여기에는 기계 감각 정보를 전달하는 안테나 기계 감각 및 운동 센터 (AMMC), 색각을 담당하는 배쪽 측면 원뇌 (vlpr), 기타 미각 및 체온과 관련된 영역이 포함됩니다 32,45.따라서 우리는 이러한 수렴 신경 연결이 여러 감각 양식을 사용하여 cLTM 검색을 매개한다고 가정했습니다.

이 가설을 테스트하기 위해 먼저 AMMC에 연결된 LH 뉴런의 하위 그룹에 초점을 맞췄습니다. 이 센터는 촉각, 청각, 고유 감각 및 바람 감지를 포함하여 Johnson의 기관으로부터 다양한 기계 감각 신호를 수신합니다 46,47,48,49. 그런 다음 이러한 신호를 LH25를 포함한 다른 뇌 영역으로 전달합니다. NP1004-Gal4의 발현 패턴은 NP1004-Gal4에서 막 표적 마커 mCD8 : GFP의 염색에 의해 가시화되었다; UAS-mCD8 : GFP가 날아갑니다 (그림 4a, 왼쪽 패널). 실제로, NP1004-Gal4 및 면역 염색에 의해 표지 된 AMMC-LH 뉴런은 시냅스 전 마커 syt :: GFP (eGFP와 시냅스 소포 단백질시 냅토 타그 민의 융합)가 NP1004-Gal4의 LH 내에서 풍부함을 보여 주었다; UAS-syt :: GFP가 날아 가며 (그림 4a, 오른쪽 패널) AMMC에서 LH 로의 시냅스 연결이 있음을 나타냅니다.

NP1004-Gal4에서 시냅스 전달 장애 cLTM 검색의 열 충격에 의한 가역적 차단; UAS-Shits가 날아갑니다 (그림 4b). 이 관찰을 뒷받침하는 R38E07-Gal4 및 NP0761-Gal4로 표지 된 AMMC 뉴런의 시냅스 전달 차단은 cLTM 검색을 억제했습니다 (그림 4c 및 보충 그림 4c). 이러한 결과는 AMMC-LH 뉴런 내의 기계 감각 정보의 표현이 cLTM 검색에 중요하다는 것을 시사합니다. 이 결론을 더 확인하기 위해 훈련 후 초파리의 주요 기계 감각 기관인 아리 스타를 제거하여 기계 감각 입력을 차단했습니다. 결과는이 치료가 cLTM을 손상 시켰지만 (그림 4d) 학습에는 영향을 미치지 않았으며 (보조 그림 4d), cLTM에서 AMMC-LH 뉴런의 역할을 시사합니다.

다음으로 칼슘 반응을 이미지화했습니다. 아리 스타에 작은 브러시로 적용된 기계 감각 자극 후 AMMC-LH 뉴런의 LH 터미널 (방법 섹션 참조). 이를 위해 NP1004-Gal4에 의해 구동되는 칼슘에 민감한 형광 단백질 인 GCamP6f를 발현시켰다. 그런 다음 LH 영역에서 GCamP6f의 형광을 기록했습니다 (그림 4e). LH 영역의 브러시와 arista 접촉에 대한 강력한 반응이 있었으며, 기계 감각 정보가 AMMC-LH 뉴런을 통해 LH로 전달된다는 개념을 뒷받침했습니다.

이러한 관찰이 행동 적으로 유의하다는 것을 확인하기 위해 모니터링했습니다. 파리에서 세포 내 칼슘 수준에 비례하여 GFP 발현을 증가시키는 세포 내 칼슘 (TRIC)의 전사 리포터를 사용하는 AMMC 뉴런 활성. AMMC 영역에서 TRIC의 형광은 검색 3 시간 후 계산되었고 파리를 제어하기 위해 정규화되었습니다 (그림 4f). 대조 파리보다 맥락 의존적 검색 후 또는 맥락-독립적 검색 후 AMMC에서 현저하게 더 큰 TRIC 신호가 관찰되었으며, 이는 AMMC 뉴런 활성이 맥락 의존적 검색과 잘 연관되어 있음을 보여준다. 따라서 LH 뉴런은 AMMC의 기계 감각 정보와 AL의 후각 정보를 통합하여 cLTM을 검색 할 수 있습니다 (그림 4g).

LH의 다중 감각 통합은 cLTM 검색의 기초가됩니다.

그런 다음 시각 시스템과 같은 다른 감각 시스템도이 과정에 관여하는지 여부를 추가로 확인했습니다. 우리는 cLTM 검색 중에 눈에서 온도에 민감한 돌연변이 Shits (UAS-Shits; GMR-Gal4) 및 시신경 뉴런 (UAS-Shits; R82D10-Gal4)의 표적 발현을 통해 시각적 입력을 차단했습니다 (보조 그림 6a). cLTM은 두 경우 모두 폐지되어 시각 시스템이 cLTM 검색에도 관여 함을 시사합니다.

이러한 시각적 입력과 기타 잠재적 인 감각 입력은 기계 감각의 경우와 마찬가지로 LH 뉴런으로 수렴됩니다. 입력. 우리는 이용 가능한 Gal4 계통에서 시냅스 전 마커 syt :: GFP의 표적 발현을 수행하고, 다음 LH 뉴런, LH (smpr-LH; MZ671-Gal4)에 대한 우수한 내측 원뇌, LH (slpr -LH; NP3060-Gal4), 복부 외측 내측 원 뇌뇌 (시각 33과 관련됨)에서 LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. 그 결과, 표적 뇌 영역의 투영이 LH 영역 (그림 5a)에 모이거나 시냅스를 만드는 것으로 나타 났으며, 이는 다양한 상황 정보가 LH로 전달된다는 것을 시사합니다.

그런 다음 cLTM 검색에서 라벨이 지정된 뉴런을 조작하는 효과를 테스트했습니다. LH 뉴런의 각 하위 그룹의 시냅스 전달을 차단하면 cLTM 검색이 폐지되었습니다 (그림 5b 및 보충 그림 5). 그러나 cLTM 검색은 LH에 투영되는 MB 출력 뉴런 (MB-V2, NP2492-Gal4로 표시됨)의 차단에 의해 영향을받지 않았으며, 이는 기존 LTM53에 필요한 것으로보고되었습니다. 이 연결은 상황과 무관 한 혐오 적 후각 기억을 검색하는 데 필요할 수 있습니다 53,54. 따라서 cLTM 검색에는 다른 별개의 감각 뇌 영역에서 LH 로의 시냅스 입력 통합도 포함됩니다 (그림 5c).

이러한 LH 뉴런이 기존 LTM 검색에도 관여하는지 확인하기 위해 간격 훈련 후 검색하는 동안이 뉴런. 이러한 차단은 LTM에 영향을 미치지 않았습니다 (보조 그림 5b).

cLTM 검색에서 LH 뉴런의 역할을 추가로 검증하기 위해 LH 출력 뉴런을 차단하는 효과를 테스트했습니다. LH 출력 뉴런에 라벨을 붙이기 위해 많은 Gal4 균주가 식별됩니다. 24 시간 cLTM은 PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 또는 AV6b1로 표시된 뉴런의 출력이 차단되었을 때 분명하지 않은 반면 (보조 그림 5c) AD1e1 및 AV6a1은 차단되지 않았습니다. 이러한 관찰은 LH가 cLTM 검색에서 중심적인 역할을한다는 것을 보여줍니다.

보고 된 문맥 독립적 기억 구성 요소 연구와 함께 제시된 데이터를 사용하여 cLTM 및 LTM 검색을위한 모델을 제안합니다 (그림 6). LH의 다중 감각 통합은 cLTM의 검색 가능성을 제어하는 반면, 컨디셔닝 된 냄새만으로는 상황에 독립적 인 기억을 검색하는 데 충분합니다.