Il ripristino della griglia di rame nella provetta rivela cLTM

Tutte le pubblicazioni precedenti che coinvolgono il condizionamento olfattivo avversivo in Drosophila hanno utilizzato apparecchiature e procedure di analisi comportamentale derivate dallo stesso principio di progettazione10. Cioè, le mosche vengono addestrate in un tubo di addestramento con una superficie a griglia di rame che eroga scosse elettriche (Fig. 1a, pannello di sinistra) e testate in tubi di prova senza la griglia di rame (Fig. 1a, pannello centrale). Pertanto, in nessuno studio precedente il recupero di componenti di memoria avversiva ha richiesto la presenza della griglia di rame. Quando la griglia di rame è stata reintegrata nelle provette (Fig. 1a, pannello di destra), una procedura che non influisce sull’acuità degli odori (Tab. 1 supplementare) o porta a prestazioni di falsa memoria (Fig. 1a supplementare), il test comportamentale ha rivelato effetti sorprendenti. Il condizionamento a prova singola ha prodotto un componente di memoria dipendente dalla griglia di rame che è durato più a lungo di quelli visti in precedenza, anche in prove ripetute e distanziate. Nello specifico, la memoria è durata almeno 14 giorni, che è stato il periodo più lungo testato (Fig. 1b).

Per determinare se questo miglioramento della memoria dipendente dalla griglia di rame riflette gli effetti generali del ripristino del contesto, abbiamo cercato di alterare altri elementi dell’ambiente di allenamento, in particolare il colore della luce circostante e la temperatura ambientale come mosche sono in grado di rispondere a entrambi32,33. Quando la luce rossa di allenamento è stata cambiata in gialla durante il test, o viceversa, il miglioramento della memoria non si è verificato, anche quando è stata fornita la griglia di rame (Fig. 1c e Fig. 1c supplementare). Allo stesso modo, il miglioramento è scomparso quando la temperatura del test era notevolmente diversa dalla temperatura di apprendimento (23 ° C contro 32 ° C, o viceversa; Fig. 1c e Fig. 1d supplementare). Pertanto, la modifica di qualsiasi condizione ambientale del contesto di codifica bloccava completamente la memoria dipendente dalla griglia di rame.

Tuttavia, la differenza tra l’ambiente di codifica e l’ambiente di test doveva essere sufficientemente significativa o facilmente rilevabile da influenzare il recupero di la memoria dipendente dalla rete in rame. Ad esempio, il miglioramento della memoria è stato preservato quando la temperatura di test è stata modificata da una temperatura di codifica di 23 ° C a una temperatura di test di 25 ° C (Figura 1e supplementare).

In ogni caso, recupero del rame La memoria dipendente dalla rete richiede un odore condizionato e il pieno ripristino del contesto ambientale di codifica. Questo è il motivo per cui abbiamo definito questo componente della memoria come LTM dipendente dal contesto (cLTM).

cLTM non richiede consolidamento dipendente dalla sintesi proteica

Poiché la maggior parte degli studi ha suscitato LTM solo utilizzando protocolli di addestramento distanziati e poiché LTM dipende dalla sintesi proteica3, abbiamo ulteriormente determinato se il consolidamento dipendente dalla sintesi proteica è necessario per cLTM.Sorprendentemente, la formazione di tale memoria a lunga durata era indipendente dalla sintesi proteica, poiché la somministrazione di cicloesimide (CXM), un inibitore della sintesi proteica, non ha avuto alcun impatto sulla formazione di cLTM (Fig. 1d), mentre lo stesso trattamento ha bloccato la formazione di LTM (Fig. . 1f), come previsto3,8,9. A sostegno di questa osservazione, l’inibizione della sintesi proteica attraverso l’espressione pan-neuronale di RICIN34, una proteina che inattiva i ribosomi eucariotici, nelle mosche transgeniche (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) non ha mostrato alcun effetto sulla formazione di cLTM (Figura complementare 1g). Abbiamo ulteriormente confermato tale indipendenza attraverso l’espressione pan-neuronale (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) di un’isoforma repressiva della proteina 2 di legame dell’elemento cAMP-response (CREB2b) che è segnalato per bloccare LTM5 nelle mosche transgeniche non ha avuto alcun impatto su cLTM ( Fig. 1g). Inoltre, i mutanti rutabaga (rut) della memoria e dell’apprendimento classico, rut1 e rut2080, con sintesi di cAMP attenuata, hanno eseguito il normale cLTM (Fig. 1h). Pertanto, i dati presentati suggeriscono fortemente che la formazione di cLTM non richiede sintesi proteica e quindi è diversa dalla LTM indipendente dal contesto. cLTM è anche distinguibile dalla memoria resistente all’anestesia (ARM) perché rimane normale in un mutante di ravanello (Figura supplementare 1h) mentre ARM è alterato35.

Per convalidare questi risultati sorprendenti, abbiamo determinato se la formazione di cLTM richiede tempo, un’altra indicazione di consolidamento. A tal fine, abbiamo caratterizzato la resistenza del cLTM al trattamento con shock freddo, che è noto per abolire la memoria a breve e medio termine3,8. Ventiquattro ore dopo l’allenamento, cLTM è rimasto inalterato (Fig. 1d) dal tipico trattamento a freddo. Tale resistenza allo shock da freddo ci ha permesso di eseguire due esperimenti di follow-up:

In primo luogo, abbiamo applicato il trattamento di shock a freddo per 2 minuti immediatamente dopo una prova di condizionamento. Dopo 3 minuti di riposo dallo shock da freddo, un test comportamentale ha mostrato che il cLTM resistente allo shock da freddo era già formato a piena forza (circa il 20% dell’indice di prestazione; Fig. 1e). In secondo luogo, per convalidare ulteriormente l’osservazione, abbiamo ridotto la forza della scarica elettrica di addestramento da 60 a 20 V per evitare qualsiasi effetto limite della forza della memoria. Abbiamo scoperto che, anche con una forza di allenamento così debole, cLTM si formava immediatamente, perché miglioramenti simili erano immediatamente presenti nella memoria, indicando che la formazione di cLTM si è mantenuta per lungo tempo senza decadere (Fig. 1f). Pertanto, cLTM si forma entro 3 minuti dopo l’allenamento, suggerendo che non è richiesto alcun consolidamento della sintesi proteica per la sua formazione.

Questa sorprendente osservazione ci ha spinto a indagare se cLTM è diverso dal LTM tradizionale o semplicemente costituisce lo stesso memoria recuperata in diversi contesti ambientali. Molteplici linee di evidenza, presentate di seguito, suggeriscono che cLTM è un componente di memoria distinto con diverse caratteristiche molecolari e anatomiche.

I neuroni dopaminergici sono coinvolti nella formazione di cLTM

La formazione di LTM richiede neuroni dopaminergici ( DAN), quindi abbiamo esaminato il ruolo dei DAN nella codifica cLTM, confrontando la memoria di 24 ore nelle mosche di controllo con quella nelle mosche le cui uscite sinaptiche dai DAN erano bloccate durante l’allenamento. A questo scopo, l’espressione di UAS-Shibirets1 (Shits) è stata mirata ai DAN attraverso TH-Gal4, in modo che la normale uscita sinaptica fosse consentita a temperature permissive (23 ° C) ma bloccata a temperature restrittive (32 ° C) 36. Per garantire condizioni ambientali costanti tra allenamento e test, abbiamo adottato un regime rigoroso per i trattamenti termici. In particolare, per bloccare la trasmissione sinaptica durante l’allenamento, le mosche sono state spostate in un ambiente a 32 ° C 30 minuti prima dell’allenamento e di nuovo a 23 ° C immediatamente prima dell’allenamento. Hanno quindi completato l’addestramento entro 5 minuti e sono stati testati 24 ore dopo a 23 ° C. Entro la finestra di tempo data (5 min), la trasmissione sinaptica dei neuroni che esprimono Shits è rimasta bloccata (Figura 2a supplementare). Allo stesso modo, nel caso di test che richiedevano il blocco dei neuroni durante il test, le mosche sono state spostate in un ambiente a 32 ° C prima del test, ma sono state addestrate e testate a 23 ° C (Fig. 2a). I risultati hanno mostrato che il blocco del rilascio del neurotrasmettitore da neuroni marcati con TH-Gal4 ha compromesso la formazione di cLTM, suggerendo che i DAN sono necessari per la codifica cLTM. Questa conclusione è stata ulteriormente supportata dal test comportamentale, che ha mostrato che nessun cLTM si è verificato nelle mosche mutanti del recettore della dopamina (dDA1) della Drosophila D1 (dDA1dumb2) 37 o nelle mosche con atterramento pan-neuronale di dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb -Gal4) (Fig. 2b). Ciò suggerisce che la neuromodulazione mediata da dDA1 gioca un ruolo nell’acquisizione di cLTM.

Tuttavia, i dDA1 espressi nei neuroni MB non erano coinvolti nell’acquisizione di cLTM, perché la sovraespressione mirata di dDA1 nei neuroni MB su uno sfondo mutante dDA1dumb2 (dDA1dumb2; OK107-Gal4) non è riuscita a salvare l’acquisizione di cLTM. Coerentemente con questo, il knockdown di dDA1 nei neuroni MB (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) non ha influenzato cLTM. Questi dati suggeriscono che cLTM è codificato dalla neuromodulazione mediata da dDA1, ma non nel MB.

Il recupero di cLTM è indipendente dai neuroni del corpo dei funghi

È interessante notare che i dDA1 nei neuroni MB erano non coinvolti nell’acquisizione di cLTM, mentre tutti gli studi precedenti in questo campo hanno rilevato che la formazione di componenti di memoria avversiva e indipendenti dal contesto, inclusa la LTM tradizionale, coinvolge i neuroni MB38,39,40,41. Per confermare questa osservazione, abbiamo esaminato i ruoli dei neuroni MB nel recupero di cLTM. A tal fine, l’espressione di UAS-Shits è stata mirata ai neuroni MB attraverso due driver Gal4 indipendenti: OK107-Gal4 e C772-Gal4 (Figura supplementare 2b, c). Sebbene il recupero di LTM non sia riuscito in OK107-Gal4; UAS-Shits vola (Figura 2d), cLTM è rimasto intatto in OK107-Gal4; UAS-Shits e C772-Gal4; UAS-Shits vola (Fig. 2c, d), confermando che I neuroni MB non sono coinvolti nella formazione o nel recupero di cLTM.

Il recupero di cLTM richiede AL e neuroni di proiezione

Per identificare quali regioni del cervello sono necessarie per il recupero di cLTM, abbiamo studiato il ruolo di Neuroni locali AL e neuroni di proiezione (PN). Le informazioni olfattive nelle mosche vengono trasmesse dai neuroni sensoriali ai neuroni AL e PN che poi si biforcano a MB e LH42. Abbiamo prima testato gli effetti del blocco dell’output sinaptico da neuroni locali AL etichettati da OK66-Gal4 (Figura supplementare 3a). Il blocco della trasmissione sinaptica a temperatura restrittiva ha abolito cLTM in OK66-Gal4; UAS-Shits vola (Fig. 3a). Abbiamo quindi testato gli effetti di due distinti sottogruppi di neuroni di proiezione, con neuroni di proiezione eccitatori (ePN) che proiettano sia su MB che su LH, etichettati da GH146-Gal4 (Figura supplementare 3b) e neuroni di proiezione inibitori (iPN) che proiettano solo su la regione LH, contrassegnata da MZ699-Gal4 (Figura supplementare 3c). Il miglioramento della memoria di 24 ore in presenza di griglie non era evidente quando l’output di ePN o iPN era bloccato (Fig. 3b, c). Queste osservazioni dimostrano che i neuroni AL e PN partecipano alla trasmissione delle informazioni olfattive durante il recupero di cLTM, come con tutti i componenti della memoria indipendenti dal contesto precedentemente identificati. Al contrario, gli iPN etichettati con MZ699-Gal4, che proiettano sull’LH, sono necessari per l’assuefazione olfattiva, ma non per il recupero della memoria indipendente dal contesto28,43. Questo effetto di MZ699-Gal4 implica che l’LH gioca un ruolo nel recupero di cLTM.

Il recupero di cLTM richiede neuroni LH e AMMC

È interessante notare che i neuroni LH sono collegati a più regioni cerebrali remote25. Una recente scoperta riporta che l’LH riceve input multisensoriali dalle regioni del cervello di vari sistemi sensoriali44. Questi includono il centro meccanosensoriale e motorio antenne (AMMC), che comunica informazioni meccanosensoriali, il protocerebrum laterale ventrale (vlpr), responsabile della visione dei colori33 e altre aree coinvolte nel gusto e nella temperatura32,45.Abbiamo quindi ipotizzato che tali connessioni neuronali convergenti mediano il recupero di cLTM utilizzando più modalità sensoriali.

Per testare questa ipotesi, ci siamo prima concentrati su un sottogruppo di neuroni LH collegati all’AMMC. Questo centro riceve diversi segnali meccanosensoriali dall’organo di Johnson, inclusi il tatto, l’udito, la propriocezione e il rilevamento del vento46,47,48,49. Quindi trasmette questi segnali ad altre regioni del cervello, incluso l’LH25. Il pattern di espressione di NP1004-Gal4 è stato visualizzato mediante colorazione del marcatore target di membrana mCD8: GFP in NP1004-Gal4; UAS-mCD8: GFP vola (Fig. 4a, pannello di sinistra). Infatti, i neuroni AMMC-LH etichettati da NP1004-Gal4 e l’immunocolorazione hanno mostrato che il marker presinaptico syt :: GFP (una fusione di eGFP e la proteina della vescicola sinaptica sinaptotagmina) è arricchito all’interno dell’LH di NP1004-Gal4; UAS-syt :: GFP vola (Fig. 4a, pannello di destra), suggerendo che ci sono connessioni sinaptiche dall’AMMC all’LH.

Il blocco reversibile indotto da shock termico della trasmissione sinaptica ha compromesso il recupero di cLTM in NP1004-Gal4; UAS-Shits vola (Fig. 4b). A conferma di questa osservazione, il blocco della trasmissione sinaptica nei neuroni AMMC etichettati con R38E07-Gal4 e NP0761-Gal4 ha anche soppresso il recupero di cLTM (Fig. 4c e Figura supplementare 4c). Questi risultati suggeriscono che la rappresentazione delle informazioni meccanosensoriali all’interno dei neuroni AMMC-LH è fondamentale per il recupero di cLTM. Per confermare ulteriormente questa conclusione, abbiamo bloccato gli input meccanosensoriali rimuovendo l’arista, che è un importante organo meccanosensoriale in Drosophila, dopo l’allenamento. I risultati hanno mostrato che questo trattamento alterava la cLTM (Fig. 4d) ma non ha avuto alcun impatto sull’apprendimento (Figura supplementare. 4d), suggerendo un ruolo per i neuroni AMMC-LH in cLTM.

Successivamente, abbiamo immaginato le risposte del calcio il terminale LH dei neuroni AMMC-LH dopo lo stimolo meccanosensoriale applicato con un piccolo pennello all’arista (vedere la sezione Metodi). A tal fine, abbiamo espresso GCamP6f, una proteina fluorescente sensibile al calcio50, guidata da NP1004-Gal4. Abbiamo quindi registrato la fluorescenza di GCamP6f dalle regioni LH (Fig. 4e). Ci sono state risposte robuste al contatto arista con il pennello nella regione LH, supportando l’idea che le informazioni meccanosensoriali siano trasmesse all’LH attraverso i neuroni AMMC-LH.

Per confermare che queste osservazioni erano significative dal punto di vista comportamentale, abbiamo monitorato Attività neuronale AMMC utilizzando il reporter trascrizionale del calcio intracellulare (TRIC) 51, che aumenta l’espressione di GFP in proporzione ai livelli di calcio intracellulare nelle mosche. La fluorescenza del TRIC dalla regione AMMC è stata calcolata 3 ore dopo il recupero e normalizzata per controllare le mosche (Fig. 4f). Un segnale TRIC significativamente maggiore è stato osservato nell’AMMC dopo il recupero dipendente dal contesto rispetto alle mosche di controllo o dopo il recupero indipendente dal contesto, dimostrando che l’attività neuronale dell’AMMC si correla bene con il recupero dipendente dal contesto. Pertanto, i neuroni LH sono in grado di integrare le informazioni meccanosensoriali dall’AMMC e le informazioni olfattive dall’AL per recuperare cLTM (Fig. 4g).

L’integrazione multisensoriale nell’LH è alla base del recupero di cLTM

Abbiamo quindi verificato ulteriormente se altri sistemi sensoriali fossero coinvolti in questo processo, come il sistema visivo. Abbiamo bloccato l’input visivo attraverso l’espressione mirata di mutanti mutanti sensibili alla temperatura negli occhi (UAS-Shits; GMR-Gal4) e dei neuroni del lobo ottico (UAS-Shits; R82D10-Gal4) durante il recupero di cLTM (Figura 6a supplementare). cLTM sono stati aboliti in entrambi i casi, suggerendo che anche il sistema visivo è coinvolto nel recupero di cLTM.

Tale input visivo così come altri potenziali input sensoriali presumibilmente converge ai neuroni LH, proprio come nel caso del meccanosensoriale ingresso. Abbiamo eseguito l’espressione mirata del marker presinaptico syt :: GFP nelle linee Gal4 disponibili, etichettando i seguenti neuroni LH, protocerebrum mediale superiore a LH (smpr-LH; MZ671-Gal4), protocerebrum laterale superiore (rilevante per il gusto52) a LH (slpr -LH; NP3060-Gal4) e protocerebrum mediale laterale ventrale (rilevante per visuale33) a LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. I risultati hanno mostrato che le proiezioni da regioni cerebrali mirate si riuniscono, o creano sinapsi, nella regione LH (Fig. 5a), suggerendo che diverse informazioni contestuali vengono trasmesse all’LH.

Abbiamo quindi testato gli effetti della manipolazione dei neuroni etichettati sul recupero di cLTM. Il blocco della trasmissione sinaptica di ciascun sottogruppo di neuroni LH ha abolito il recupero di cLTM (Fig. 5b e Fig. 5 supplementare). Tuttavia, il recupero di cLTM non è stato influenzato dal blocco dei neuroni di output MB (MB-V2, etichettati da NP2492-Gal4) che proiettano all’LH, che è stato segnalato come richiesto per l’LTM53 tradizionale. Questa connessione può essere necessaria per il recupero della memoria olfattiva avversiva indipendente dal contesto53,54. Pertanto, il recupero di cLTM comporta anche l’integrazione di input sinaptici da altre regioni cerebrali sensoriali distinte all’LH (Fig. 5c).

Per determinare se questi neuroni LH sono coinvolti anche nel recupero del LTM tradizionale, abbiamo bloccato questi neuroni durante il recupero dopo l’allenamento distanziato. Tale blocco non ha esercitato alcun impatto su LTM (Figura supplementare 5b).

Per convalidare ulteriormente un ruolo dei neuroni LH nel recupero di cLTM, abbiamo quindi testato gli effetti del blocco dei neuroni di output LH. Sono stati identificati numerosi ceppi Gal4 per etichettare i neuroni di output di LH44. Il cLTM 24-h non era evidente quando l’uscita dei neuroni etichettati da PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 o AV6b1 era bloccata (Figura supplementare 5c), mentre AD1e1 e AV6a1 non lo erano. Queste osservazioni dimostrano che LH gioca un ruolo centrale nel recupero di cLTM.

Prendendo i dati presentati insieme allo studio riportato sui componenti della memoria indipendenti dal contesto, siamo portati a proporre un modello per il recupero di cLTM e LTM (Fig. . 6). L’integrazione multisensoriale nelle porte LH la recuperabilità di cLTM mentre l’odore condizionato da solo è sufficiente per il recupero di memorie indipendenti dal contesto.