La réinstallation de la grille en cuivre dans le tube à essai révèle cLTM

Toutes les publications précédentes impliquant un conditionnement olfactif aversif chez la drosophile ont utilisé des appareils de test comportemental et des procédures dérivées du même principe de conception10. Autrement dit, les mouches sont entraînées dans un tube d’entraînement avec une surface de grille en cuivre qui délivre des chocs électriques (Fig. 1a, panneau de gauche) et testées dans des tubes à essai sans grille de cuivre (Fig. 1a, panneau du milieu). Ainsi, dans aucune étude antérieure, la récupération de composants de mémoire aversifs n’a nécessité la présence de la grille de cuivre. Lorsque la grille de cuivre a été rétablie dans les tubes à essai (Fig.1a, panneau de droite) – une procédure qui n’affecte pas l’acuité des odeurs (Tab.1 supplémentaire) ou n’entraîne pas de fausses performances de mémoire (Fig.1a supplémentaire), le test comportemental a révélé effets frappants. Le conditionnement à essai unique a produit un composant de mémoire dépendant de la grille de cuivre qui a duré plus longtemps que ceux observés précédemment, même dans des essais répétés et espacés. Plus précisément, la mémoire a duré au moins 14 jours, ce qui était la plus longue période testée (Fig. 1b).

Pour déterminer si cette amélioration de la mémoire dépendante de la grille de cuivre reflète les effets généraux de la restauration du contexte, nous avons essayé de modifier d’autres éléments de l’environnement d’entraînement, en particulier la couleur de la lumière environnante et la température ambiante lorsque les mouches sont capables de répondre à la fois32,33. Lorsque la lumière de formation rouge a été commutée sur jaune lors des tests, ou vice versa, l’amélioration de la mémoire n’a pas pu se produire, même lorsque la grille de cuivre était fournie (Fig. 1c et Fig. 1c supplémentaire). De même, l’amélioration a disparu lorsque la température de test était nettement différente de la température d’apprentissage (23 ° C contre 32 ° C, ou vice versa; Fig. 1c et Fig. 1d supplémentaire). Par conséquent, la modification de toute condition environnementale du contexte de codage bloquait complètement la mémoire dépendante de la grille de cuivre.

Cependant, la différence entre l’environnement de codage et l’environnement de test devait être suffisamment significative ou facilement détectable pour affecter la récupération de la mémoire dépendante de la grille de cuivre. Par exemple, l’amélioration de la mémoire a été préservée lorsque la température de test a été modifiée d’une température de codage de 23 ° C à une température de test de 25 ° C (Fig. 1e supplémentaire).

Dans tous les cas, récupération du cuivre la mémoire dépendante de la grille nécessite une odeur conditionnée et une restauration complète du contexte environnemental de codage. C’est pourquoi nous avons qualifié ce composant de mémoire de LTM contextuel (cLTM).

cLTM ne nécessite aucune consolidation dépendante de la synthèse des protéines

Puisque la plupart des études n’ont suscité que du LTM en utilisant des protocoles d’entraînement espacés , et parce que la LTM dépend de la synthèse des protéines3, nous avons en outre déterminé si la consolidation dépendante de la synthèse des protéines est nécessaire pour la cLTM.De manière remarquable, la formation d’une telle mémoire durable était indépendante de la synthèse des protéines, car l’administration de cycloheximide (CXM), un inhibiteur de la synthèse des protéines, n’avait aucun impact sur la formation de cLTM (Fig.1d), alors que le même traitement bloquait la formation de LTM (Fig. . 1f), comme prévu3,8,9. À l’appui de cette observation, l’inhibition de la synthèse des protéines par l’expression pan-neuronale de RICIN34, une protéine inactivant les ribosomes eucaryotes, chez les mouches transgéniques (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) n’a pas non plus montré d’effet sur la formation de cLTM (Fig.1g supplémentaire). Nous avons confirmé cette indépendance par l’expression pan-neuronale (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) d’une isoforme répresseur de la protéine 2 de liaison à l’élément de réponse à l’AMPc (CREB2b) qui bloque LTM5 chez les mouches transgéniques n’a eu aucun impact sur cLTM ( Fig. 1g). De plus, les mutants classiques d’apprentissage et de mémoire rutabaga (rut), rut1 et rut2080, avec une synthèse d’AMPc atténuée, ont réalisé un cLTM normal (Fig. 1h). Ainsi, les données présentées suggèrent fortement que la formation de cLTM ne nécessite aucune synthèse protéique et est donc différente du LTM indépendant du contexte. La cLTM se distingue également de la mémoire résistante à l’anesthésie (ARM) car elle reste normale chez un mutant de radis (Fig. supplémentaire 1h) alors que l’ARM est altérée35.

Pour valider ces découvertes surprenantes, nous avons déterminé si la formation de cLTM prend du temps, une autre indication de consolidation. À cette fin, nous avons caractérisé la résistance du cLTM au traitement par choc à froid, connu pour abolir la mémoire à court et moyen terme3,8. Vingt-quatre heures après l’entraînement, la cLTM n’a pas été affectée (Fig. 1d) par un traitement de choc par le froid typique. Une telle résistance au choc à froid nous a permis de réaliser deux expériences de suivi:

Premièrement, nous avons appliqué un traitement de choc à froid pendant 2 minutes immédiatement après un essai de conditionnement. Après 3 min de repos après le choc à froid, un test comportemental a montré que le cLTM résistant aux chocs à froid était déjà formé à pleine puissance (environ 20% de l’indice de performance; Fig. 1e). Deuxièmement, pour valider davantage l’observation, nous avons réduit la force du choc électrique d’entraînement de 60 à 20 V pour éviter tout effet plafond de la force de la mémoire. Nous avons constaté que, même à une force d’entraînement aussi faible, cLTM se formait immédiatement, car des améliorations similaires étaient immédiatement présentes dans la mémoire, indiquant que la formation de cLTM était maintenue pendant une longue période sans se décomposer (Fig. 1f). Ainsi, le cLTM est formé dans les 3 minutes après l’entraînement, ce qui suggère qu’aucune consolidation de la synthèse des protéines n’est requise pour sa formation.

Cette observation surprenante nous a incités à déterminer si le cLTM est différent du LTM traditionnel ou s’il constitue simplement mémoire récupérée dans différents contextes environnementaux. Plusieurs éléments de preuve, présentés ci-dessous, suggèrent que cLTM est un composant mémoire distinct avec différentes caractéristiques moléculaires et anatomiques.

Les neurones dopaminergiques sont impliqués dans la formation de cLTM

La formation de LTM nécessite des neurones dopaminergiques ( DAN), nous avons donc examiné le rôle des DAN dans le codage cLTM, en comparant la mémoire de 24 h dans les mouches de contrôle avec celle des mouches dont les sorties synaptiques des DAN étaient bloquées pendant l’entraînement. À cette fin, l’expression de UAS-Shibirets1 (Shits) a été ciblée sur les DAN via TH-Gal4, de sorte que la sortie synaptique normale était autorisée à des températures permissives (23 ° C) mais bloquée à des températures restrictives (32 ° C) 36. Pour garantir des conditions environnementales cohérentes entre la formation et les tests, nous avons adopté un régime strict de traitements thermiques. Plus précisément, pour bloquer la transmission synaptique pendant l’entraînement, les mouches ont été déplacées dans un environnement à 32 ° C 30 minutes avant l’entraînement et de nouveau à 23 ° C immédiatement avant l’entraînement. Ils ont ensuite terminé la formation en 5 min et ont été testés 24 h plus tard à 23 ° C. Dans la fenêtre de temps donnée (5 min), la transmission synaptique des neurones exprimant Shits est restée bloquée (Fig. 2a supplémentaire). De même, dans le cas des tests nécessitant un blocage des neurones pendant les tests, les mouches ont été déplacées dans un environnement à 32 ° C avant les tests, mais ont été entraînées et testées à 23 ° C (Fig. 2a). Les résultats ont montré que le blocage de la libération de neurotransmetteur à partir des neurones marqués par TH-Gal4 altérait la formation de cLTM, ce qui suggère que les DAN sont nécessaires pour le codage cLTM. Cette conclusion a également été étayée par le test comportemental, qui a montré qu’aucune cLTM ne s’est produite dans les mouches mutantes du récepteur de la dopamine D1 de la drosophile (dDA1) (dDA1dumb2) 37 ou chez les mouches avec knockdown pan-neuronal de dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb -Gal4) (Fig.2b). Cela suggère que la neuromodulation médiée par dDA1 joue un rôle dans l’acquisition de cLTM.

Cependant, les dDA1 exprimés dans les neurones MB n’étaient pas impliqués dans l’acquisition de cLTM, car la surexpression ciblée de dDA1 dans les neurones MB sur un fond mutant dDA1dumb2 (dDA1dumb2; OK107-Gal4) n’a pas réussi à sauver l’acquisition de cLTM. Conformément à cela, le renversement de dDA1 dans les neurones MB (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) n’a pas affecté le cLTM. Ces données suggèrent que cLTM est codé par la neuromodulation médiée par dDA1, mais pas dans le MB.

La récupération de cLTM est indépendante des neurones du corps champignon

Fait intéressant, les dDA1 dans les neurones MB étaient pas impliqué dans l’acquisition de cLTM, alors que toutes les études précédentes dans ce domaine ont montré que la formation de composants de mémoire aversifs indépendants du contexte, y compris le LTM traditionnel, implique des neurones MB38,39,40,41. Pour confirmer cette observation, nous avons examiné les rôles des neurones MB dans la récupération cLTM. À cette fin, l’expression de UAS-Shits a été ciblée sur les neurones MB via deux pilotes Gal4 indépendants: OK107-Gal4 et C772-Gal4 (Fig. 2b, c supplémentaire). Bien que la récupération LTM ait échoué dans OK107-Gal4; les mouches UAS-Shits (Fig.2d supplémentaire), cLTM est restée intacte dans OK107-Gal4; UAS-Shits et C772-Gal4; UAS-Shits mouches (Fig.2c, d), confirmant Les neurones MB ne sont pas impliqués dans la formation ou la récupération de cLTM.

La récupération de cLTM nécessite des neurones AL et de projection

Pour identifier les régions du cerveau nécessaires à la récupération de cLTM, nous avons étudié le rôle de Neurones locaux AL et neurones de projection (PN). Les informations olfactives chez les mouches sont transmises des neurones sensoriels aux neurones AL et aux PN qui bifurquent ensuite vers le MB et le LH42. Nous avons d’abord testé les effets du blocage de la sortie synaptique des neurones locaux AL marqués par OK66-Gal4 (Fig. 3a supplémentaire). Le blocage de la transmission synaptique à une température restrictive a aboli la cLTM dans OK66-Gal4; UAS-Shits vole (Fig. 3a). Nous avons ensuite testé les effets de deux sous-groupes distincts de neurones de projection, avec des neurones de projection excitatrice (ePN) se projetant à la fois vers le MB et la LH, marqués par GH146-Gal4 (Fig.3b supplémentaire), et les neurones de projection inhibitrice (iPN) projetant uniquement la région LH, marquée par MZ699-Gal4 (Fig. 3c supplémentaire). L’amélioration de la mémoire de 24 h en présence de grilles n’était pas évidente lorsque la sortie des ePN ou des iPN était bloquée (Fig. 3b, c). Ces observations démontrent que les neurones AL et les PN participent à la transmission d’informations olfactives pendant la récupération cLTM, comme avec tous les composants de mémoire indépendants du contexte précédemment identifiés. En revanche, les iPN étiquetés avec MZ699-Gal4, qui se projettent vers la LH, sont nécessaires pour l’accoutumance olfactive, mais pas pour la récupération de la mémoire indépendante du contexte28,43. Cet effet de MZ699-Gal4 implique que la LH joue un rôle dans la récupération cLTM.

La récupération de cLTM nécessite des neurones LH et AMMC

Fait intéressant, les neurones LH sont connectés à plusieurs régions cérébrales distantes25. Une découverte récente rapporte que la LH reçoit des entrées multisensorielles des régions cérébrales de divers systèmes sensoriels44. Ceux-ci incluent le centre antennaire mécano-sensoriel et moteur (AMMC), qui communique des informations mécanosensorielles, le protocole latéral ventral (vlpr), qui est responsable de la vision des couleurs33, et d’autres zones impliquées dans le goût et la température32,45.Nous avons donc émis l’hypothèse que de telles connexions neuronales convergentes médiatisent la récupération de cLTM en utilisant plusieurs modalités sensorielles.

Pour tester cette hypothèse, nous nous sommes d’abord concentrés sur un sous-groupe de neurones LH liés à l’AMMC. Ce centre reçoit divers signaux mécanosensoriels de l’organe de Johnson, notamment le toucher, l’audition, la proprioception et la détection du vent46,47,48,49. Il relaie ensuite ces signaux vers d’autres régions du cerveau, y compris le LH25. Le modèle d’expression de NP1004-Gal4 a été visualisé par coloration du marqueur cible membranaire mCD8: GFP dans NP1004-Gal4; UAS-mCD8: GFP vole (Fig. 4a, panneau de gauche). En effet, les neurones AMMC-LH marqués par NP1004-Gal4 et immunocoloration ont montré que le marqueur présynaptique syt :: GFP (une fusion d’eGFP et de la protéine synaptique de la vésicule synaptotagmine) est enrichi au sein de la LH de NP1004-Gal4; UAS-syt :: GFP vole (Fig. 4a, panneau de droite), suggérant qu’il existe des connexions synaptiques entre l’AMMC et la LH.

Le blocage réversible induit par un choc thermique de la transmission synaptique a altéré la récupération de cLTM dans NP1004-Gal4; UAS-Shits vole (Fig. 4b). Corroborant cette observation, le blocage de la transmission synaptique dans les neurones AMMC marqués avec R38E07-Gal4 et NP0761-Gal4 a également supprimé la récupération cLTM (Fig. 4c et Fig. 4c supplémentaire). Ces résultats suggèrent que la représentation des informations mécanosensorielles dans les neurones AMMC-LH est essentielle pour la récupération cLTM. Pour confirmer davantage cette conclusion, nous avons bloqué les entrées mécanosensorielles en supprimant l’arista, qui est un organe mécanosensoriel majeur chez la drosophile, après la formation. Les résultats ont montré que ce traitement altérait la cLTM (Fig. 4d) mais n’avait aucun impact sur l’apprentissage (Fig. 4d supplémentaire), suggérant un rôle pour les neurones AMMC-LH dans cLTM.

Ensuite, nous avons imaginé les réponses calciques dans le terminal LH des neurones AMMC-LH après un stimulus mécanosensoriel appliqué avec un petit pinceau sur l’arista (voir la section Méthodes). À cette fin, nous avons exprimé GCamP6f, une protéine fluorescente sensible au calcium50, pilotée par NP1004-Gal4. Nous avons ensuite enregistré la fluorescence de GCamP6f à partir des régions LH (Fig. 4e). Il y avait des réponses robustes au contact d’arista avec la brosse dans la région LH, soutenant l’idée que les informations mécanosensorielles sont transmises à la LH par les neurones AMMC-LH.

Pour confirmer que ces observations étaient significatives sur le plan du comportement, nous avons surveillé Activité neuronale AMMC en utilisant le rapporteur transcriptionnel du calcium intracellulaire (TRIC) 51, qui augmente l’expression de la GFP proportionnellement aux niveaux de calcium intracellulaire chez les mouches. La fluorescence de TRIC de la région AMMC a été calculée 3 h après la récupération et normalisée pour contrôler les mouches (Fig. 4f). Un signal TRIC significativement plus élevé a été observé dans l’AMMC après la récupération dépendante du contexte que dans les mouches témoins ou après la récupération indépendante du contexte, montrant que l’activité neuronale de l’AMMC est bien corrélée avec la récupération dépendante du contexte. Ainsi, les neurones LH sont capables d’intégrer des informations mécanosensorielles de l’AMMC et des informations olfactives de l’AL pour récupérer cLTM (Fig. 4g).

L’intégration multisensorielle dans la LH sous-tend la récupération cLTM

Nous avons ensuite vérifié si d’autres systèmes sensoriels étaient également impliqués dans ce processus, comme le système visuel. Nous avons bloqué l’entrée visuelle par l’expression ciblée de Shits mutants sensibles à la température dans les yeux (UAS-Shits; GMR-Gal4) et les neurones du lobe optique (UAS-Shits; R82D10-Gal4) lors de la récupération de cLTM (Fig. 6a supplémentaire). Les cLTM ont été abolis dans les deux cas, suggérant que le système visuel est également impliqué dans la récupération des cLTM.

Une telle entrée visuelle ainsi que d’autres entrées sensorielles potentielles convergent supposément vers les neurones LH, tout comme dans le cas des saisir. Nous avons effectué une expression ciblée du marqueur présynaptique syt :: GFP dans les lignées Gal4 disponibles, en marquant les neurones LH suivants, le protocerebrum médial supérieur à LH (smpr-LH; MZ671-Gal4), le protocerebrum latéral supérieur (pertinent au goût52) à LH (slpr -LH; NP3060-Gal4), et protocole médial latéral ventral (pertinent pour visuel33) à LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. Les résultats ont montré que les projections des régions cérébrales ciblées se rassemblent ou forment des synapses dans la région LH (Fig. 5a), ce qui suggère que diverses informations contextuelles sont transmises à la LH.

Nous avons ensuite testé les effets de la manipulation des neurones marqués sur la récupération de cLTM. Le blocage de la transmission synaptique de chaque sous-groupe de neurones LH a aboli la récupération de cLTM (Fig. 5b et Fig. 5 supplémentaire). Cependant, la récupération de cLTM n’a pas été affectée par le blocage des neurones de sortie de MB (MB-V2, étiquetés par NP2492-Gal4) qui se projettent vers la LH, ce qui a été signalé comme nécessaire pour le LTM53 traditionnel. Cette connexion peut être nécessaire pour la récupération de la mémoire olfactive aversive indépendante du contexte53,54. Ainsi, la récupération cLTM implique également l’intégration des entrées synaptiques d’autres régions cérébrales sensorielles distinctes vers la LH (Fig. 5c).

Pour déterminer si ces neurones LH sont également impliqués dans la récupération du LTM traditionnel, nous avons bloqué ces neurones lors de la récupération après un entraînement espacé. Un tel blocage n’a exercé aucun impact sur le LTM (Fig. 5b supplémentaire).

Pour valider davantage le rôle des neurones LH dans la récupération de cLTM, nous avons ensuite testé les effets du blocage des neurones de sortie LH. Un certain nombre de souches Gal4 sont identifiées pour marquer les neurones de sortie de LH44. La cLTM 24 h n’était pas évidente lorsque la sortie des neurones marqués par PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 ou AV6b1 était bloquée (Fig. 5c supplémentaire), alors que AD1e1 et AV6a1 ne l’étaient pas. Ces observations démontrent que LH joue un rôle central dans la récupération cLTM.

En prenant les données présentées avec l’étude rapportée des composants mémoire indépendants du contexte, nous sommes amenés à proposer un modèle de récupération cLTM et LTM (Fig . 6). L’intégration multisensorielle dans les portes LH permet de récupérer le cLTM alors que l’odeur conditionnée seule est suffisante pour la récupération de mémoires indépendantes du contexte.