Die Wiederherstellung des Kupfergitters im Reagenzglas zeigt cLTM

. Alle früheren Veröffentlichungen Bei der Verwendung einer aversiven olfaktorischen Konditionierung in Drosophila wurden Verhaltensassay-Geräte und -Verfahren verwendet, die auf demselben Konstruktionsprinzip beruhen10. Das heißt, die Fliegen werden in einem Trainingsrohr mit einer Kupfergitteroberfläche trainiert, die Stromschläge liefert (Abb. 1a, linke Tafel) und in Reagenzgläsern ohne Kupfergitter (Abb. 1a, mittlere Tafel) getestet. Daher hat in keiner früheren Studie das Abrufen von aversiven Speicherkomponenten das Vorhandensein des Kupfergitters erforderlich gemacht. Wenn das Kupfergitter wieder in die Reagenzgläser eingesetzt wurde (Abb. 1a, rechte Tafel) – ein Verfahren, das die Geruchsschärfe nicht beeinflusst (ergänzende Tabelle 1) oder zu einer falschen Gedächtnisleistung führt (ergänzende Abb. 1a), ergab der Verhaltenstest auffällige Effekte. Die Einzelversuchs-Konditionierung erzeugte eine kupfergitterabhängige Speicherkomponente, die selbst in wiederholten Versuchen mit Abstand länger als die zuvor beobachteten Bestandteile hielt. Insbesondere dauerte der Speicher mindestens 14 Tage, was der längste getestete Zeitraum war (Abb. 1b).

Um festzustellen, ob diese kupfergitterabhängige Speichererweiterung die allgemeinen Auswirkungen der Wiederherstellung des Kontexts widerspiegelt, haben wir versucht, andere Elemente der Trainingsumgebung zu ändern, insbesondere die Farbe des Umgebungslichts und die Umgebungstemperatur im Flug sind in der Lage, auf beide zu reagieren32,33. Wenn das rote Trainingslicht beim Testen auf gelb geschaltet wurde oder umgekehrt, trat keine Speichererweiterung auf, selbst wenn das Kupfergitter bereitgestellt wurde (Fig. 1c und ergänzende Fig. 1c). In ähnlicher Weise verschwand die Verbesserung, wenn sich die Testtemperatur deutlich von der Lerntemperatur unterschied (23 ° C gegenüber 32 ° C oder umgekehrt; Abb. 1c und ergänzende Abb. 1d). Daher blockierte das Ändern einer Umgebungsbedingung des Codierungskontexts den kupfergitterabhängigen Speicher vollständig.

Der Unterschied zwischen der Codierungsumgebung und der Testumgebung musste jedoch ausreichend signifikant oder leicht erkennbar sein, um das Abrufen von zu beeinflussen der kupfernetzabhängige Speicher. Beispielsweise wurde die Speichererweiterung beibehalten, wenn die Testtemperatur von einer Codierungstemperatur von 23 ° C auf eine Testtemperatur von 25 ° C geändert wurde (ergänzende 1e). In jedem Fall wurde Kupfer abgerufen Der gitterabhängige Speicher erfordert einen konditionierten Geruch und die vollständige Wiederherstellung des Codierungsumgebungskontexts. Aus diesem Grund haben wir diese Speicherkomponente als kontextabhängiges LTM (cLTM) bezeichnet.

cLTM erfordert keine von der Proteinsynthese abhängige Konsolidierung

Da die meisten Studien LTM nur unter Verwendung von beabstandeten Trainingsprotokollen hervorgerufen haben und da LTM von der Proteinsynthese abhängt3, haben wir weiter festgestellt, ob eine von der Proteinsynthese abhängige Konsolidierung für cLTM erforderlich ist.Bemerkenswerterweise war die Bildung eines solchen lang anhaltenden Gedächtnisses unabhängig von der Proteinsynthese, da die Verabreichung von Cycloheximid (CXM), einem Proteinsynthesehemmer, keinen Einfluss auf die cLTM-Bildung hatte (1d), während dieselbe Behandlung die LTM-Bildung blockierte (ergänzende Abb 1f), wie erwartet3,8,9. Zur Unterstützung dieser Beobachtung zeigte die Hemmung der Proteinsynthese durch pan-neuronale Expression von RICIN34, einem Protein, das eukaryotische Ribosomen inaktiviert, in transgenen Fliegen (UAS-RICIN; nSyb-Gal4) ebenfalls keinen Effekt auf die cLTM-Bildung (ergänzende 1g). Wir haben diese Unabhängigkeit weiter bestätigt, indem die pan-neuronale Expression (UAS-dCREB2b; nSyb-Gal4) einer Repressorisoform des cAMP-Response-Element-bindenden Proteins 2 (CREB2b), von der berichtet wird, dass sie LTM5 in transgenen Fliegen blockiert, keinen Einfluss auf cLTM hatte ( Fig. 1g). Darüber hinaus führten die klassischen Lern- und Gedächtnis-Rutabaga (Rut) -Mutanten Rut1 und Rut2080 mit abgeschwächter cAMP-Synthese eine normale cLTM durch (1h). Die vorgelegten Daten legen daher den Schluss nahe, dass die Bildung von cLTM keine Proteinsynthese erfordert und sich daher von der kontextunabhängigen LTM unterscheidet. cLTM unterscheidet sich auch vom anästhesieresistenten Gedächtnis (ARM), da es in einer Rettichmutante normal bleibt (ergänzende Abb. 1h), während ARM beeinträchtigt ist35.

Um diese überraschenden Ergebnisse zu validieren, haben wir festgestellt, ob die Bildung von cLTM braucht Zeit, ein weiterer Hinweis auf Konsolidierung. Zu diesem Zweck haben wir die Resistenz von cLTM gegen Kälteschockbehandlung charakterisiert, die bekanntermaßen das Kurz- und Mittelgedächtnis aufhebt3,8. Vierundzwanzig Stunden nach dem Training blieb cLTM von einer typischen Kälteschockbehandlung unberührt (Abb. 1d). Diese Kälteschockbeständigkeit ermöglichte es uns, zwei Folgeexperimente durchzuführen:

Erstens führten wir unmittelbar nach einem Konditionierungsversuch eine 2-minütige Kälteschockbehandlung durch. Nach 3 Minuten Pause vom Kälteschock zeigte ein Verhaltenstest, dass das kälteschockresistente cLTM bereits in voller Stärke gebildet wurde (etwa 20% des Leistungsindex; Abb. 1e). Zweitens haben wir zur weiteren Validierung der Beobachtung die Stärke des elektrischen Trainingsschlags von 60 auf 20 V reduziert, um Obergrenzeneffekte der Gedächtnisstärke zu vermeiden. Wir fanden heraus, dass selbst bei einer so schwachen Trainingsstärke cLTM sofort gebildet wurde, da ähnliche Verbesserungen sofort im Gedächtnis vorhanden waren, was darauf hinweist, dass die cLTM-Bildung über einen langen Zeitraum ohne Zerfall aufrechterhalten wurde (Abb. 1f). Daher wird cLTM innerhalb von 3 Minuten nach dem Training gebildet, was darauf hindeutet, dass für seine Bildung keine Proteinsynthesekonsolidierung erforderlich ist.

Diese überraschende Beobachtung veranlasste uns zu untersuchen, ob sich cLTM von herkömmlichem LTM unterscheidet oder lediglich dasselbe darstellt Speicher in verschiedenen Umgebungskontexten abgerufen. Mehrere unten dargestellte Beweislinien legen nahe, dass cLTM eine unterschiedliche Gedächtniskomponente mit unterschiedlichen molekularen und anatomischen Merkmalen ist.

Dopaminerge Neuronen sind an der cLTM-Bildung beteiligt

Die LTM-Bildung erfordert dopaminerge Neuronen ( DANs), daher untersuchten wir die Rolle von DANs bei der cLTM-Codierung und verglichen den 24-Stunden-Speicher in Kontrollfliegen mit dem in Fliegen, deren synaptische Ausgaben von DANs während des Trainings blockiert wurden. Zu diesem Zweck wurde die Expression von UAS-Shibirets1 (Shits) über TH-Gal4 auf DANs gerichtet, so dass eine normale synaptische Ausgabe bei zulässigen Temperaturen (23 ° C) zulässig war, bei restriktiven Temperaturen (32 ° C) jedoch blockiert wurde 36. Um gleichmäßige Umgebungsbedingungen zwischen Training und Test zu gewährleisten, haben wir ein striktes Schema für Temperaturbehandlungen eingeführt. Um die synaptische Übertragung während des Trainings zu blockieren, wurden die Fliegen 30 Minuten vor dem Training in eine Umgebung mit 32 ° C und unmittelbar vor dem Training auf 23 ° C zurückgebracht. Anschließend beendeten sie das Training innerhalb von 5 Minuten und wurden 24 Stunden später bei 23 ° C getestet. Innerhalb des gegebenen Zeitfensters (5 min) blieb die synaptische Übertragung von Neuronen, die Shits exprimieren, blockiert (ergänzende Fig. 2a). In ähnlicher Weise wurden im Fall von Assays, die während des Tests eine Neuronenblockade erforderten, die Fliegen vor dem Testen in eine Umgebung mit 32 ° C gebracht, aber bei 23 ° C trainiert und getestet (2a). Die Ergebnisse zeigten, dass das Blockieren der Freisetzung von Neurotransmitter aus TH-Gal4-markierten Neuronen die cLTM-Bildung beeinträchtigte, was darauf hindeutet, dass DANs für die cLTM-Codierung erforderlich sind. Diese Schlussfolgerung wurde weiter durch den Verhaltenstest gestützt, der zeigte, dass kein cLTM in den Drosophila D1-Dopaminrezeptor (dDA1) -Mutantenfliegen (dDA1dumb2) 37 oder in Fliegen mit pan-neuronalem Knockdown von dDA1 (UAS-dDA1-RNAi; nSyb) auftrat -Gal4) (Fig. 2b). Dies legt nahe, dass die dDA1-vermittelte Neuromodulation eine Rolle bei der cLTM-Akquisition spielt.

In MB-Neuronen exprimierte dDA1s waren jedoch nicht an der cLTM-Akquisition beteiligt, da eine gezielte Überexpression von dDA1 in MB-Neuronen auf einem dDA1dumb2-Mutantenhintergrund (dDA1dumb2; OK107-Gal4) die cLTM-Akquisition nicht retten konnte. In Übereinstimmung damit hatte der Abbau von dDA1 in MB-Neuronen (OK107-Gal4; UAS-dDA1-RNAi) keinen Einfluss auf cLTM. Diese Daten legen nahe, dass cLTM durch dDA1-vermittelte Neuromodulation codiert wird, jedoch nicht im MB.

Das Abrufen von cLTM ist unabhängig von Pilzkörper-Neuronen

Interessanterweise waren es dDA1s in MB-Neuronen nicht an der cLTM-Akquisition beteiligt, während alle früheren Studien auf diesem Gebiet gezeigt haben, dass die Bildung kontextunabhängiger, aversiver Gedächtniskomponenten, einschließlich traditioneller LTM, MB-Neuronen umfasst38,39,40,41. Um diese Beobachtung zu bestätigen, untersuchten wir die Rolle von MB-Neuronen beim cLTM-Retrieval. Zu diesem Zweck wurde die Expression von UAS-Shits durch zwei unabhängige Gal4-Treiber auf MB-Neuronen gerichtet: OK107-Gal4 und C772-Gal4 (ergänzende Fig. 2b, c). Obwohl der LTM-Abruf in OK107-Gal4 fehlschlug; UAS-Shits-Fliegen (ergänzende Fig. 2d), blieb cLTM in OK107-Gal4 intakt; UAS-Shits und C772-Gal4; UAS-Shits-Fliegen (Fig. 2c, d), was dies bestätigte MB-Neuronen sind nicht an der Bildung oder dem Abrufen von cLTM beteiligt.

Das Abrufen von cLTM erfordert AL- und Projektionsneuronen

Um zu identifizieren, welche Gehirnregionen für das Abrufen von cLTM erforderlich sind, haben wir die Rolle von untersucht AL lokale Neuronen und Projektionsneuronen (PNs). Riechinformationen in Fliegen werden von sensorischen Neuronen an AL-Neuronen und PNs weitergeleitet, die sich dann an MB und LH42 teilen. Wir haben zuerst die Auswirkungen der Blockierung der synaptischen Ausgabe von lokalen AL-Neuronen getestet, die mit OK66-Gal4 markiert sind (ergänzende Abb. 3a). Die Blockade der synaptischen Übertragung bei restriktiver Temperatur hob cLTM in OK66-Gal4 auf; UAS-Shits fliegt (Abb. 3a). Wir testeten dann die Wirkungen von zwei unterschiedlichen Untergruppen von Projektionsneuronen, wobei exzitatorische Projektionsneuronen (ePNs) sowohl auf MB als auch auf LH projizierten, markiert mit GH146-Gal4 (ergänzende 3b), und inhibitorische Projektionsneuronen (iPNs) nur auf die LH-Region, markiert mit MZ699-Gal4 (ergänzende Fig. 3c). Die 24-Stunden-Speichererweiterung bei Vorhandensein von Gittern war nicht erkennbar, wenn die Ausgabe von ePNs oder iPNs blockiert wurde (Abb. 3b, c). Diese Beobachtungen zeigen, dass AL-Neuronen und PNs wie bei allen zuvor identifizierten kontextunabhängigen Speicherkomponenten an der olfaktorischen Informationsübertragung während des cLTM-Abrufs beteiligt sind. Im Gegensatz dazu sind mit MZ699-Gal4 markierte iPNs, die zum LH projizieren, für die olfaktorische Gewöhnung erforderlich, nicht jedoch für das Abrufen des kontextunabhängigen Speichers28,43. Dieser Effekt von MZ699-Gal4 impliziert, dass der LH eine Rolle beim Abrufen von cLTM spielt.

Das Abrufen von cLTM erfordert LH- und AMMC-Neuronen.

Interessanterweise sind LH-Neuronen mit mehreren entfernten Hirnregionen verbunden25. Eine kürzlich entdeckte Entdeckung berichtet, dass der LH multisensorische Eingaben von Gehirnregionen verschiedener sensorischer Systeme erhält44. Dazu gehören das mechanosensorische und motorische Antennenzentrum (AMMC), das mechanosensorische Informationen übermittelt, das ventrale laterale Protocerebrum (vlpr), das für das Farbsehen verantwortlich ist33, und andere Bereiche, die an Geschmack und Temperatur beteiligt sind32,45.Wir stellten daher die Hypothese auf, dass solche konvergierenden neuronalen Verbindungen den cLTM-Abruf unter Verwendung mehrerer sensorischer Modalitäten vermitteln.

Um diese Hypothese zu testen, konzentrierten wir uns zunächst auf eine Untergruppe von LH-Neuronen, die mit der AMMC verbunden sind. Dieses Zentrum empfängt verschiedene mechanosensorische Signale von Johnsons Organ, darunter Berührung, Hören, Propriozeption und Windmessung46,47,48,49. Diese Signale werden dann an andere Gehirnregionen weitergeleitet, einschließlich des LH25. Das Expressionsmuster von NP1004-Gal4 wurde durch Anfärben des Membranzielmarkers mCD8: GFP in NP1004-Gal4 sichtbar gemacht; UAS-mCD8: GFP fliegt (Abb. 4a, linkes Feld). In der Tat zeigten AMMC-LH-Neuronen, die mit NP1004-Gal4 und Immunfärbung markiert waren, dass der präsynaptische Marker syt :: GFP (eine Fusion von eGFP und dem synaptischen Vesikelprotein Synaptotagmin) innerhalb des LH von NP1004-Gal4 angereichert ist; UAS-syt :: GFP fliegt (Abb. 4a, rechtes Feld), was darauf hindeutet, dass es synaptische Verbindungen von der AMMC zur LH gibt.

Hitzeschock-induzierte reversible Blockade der synaptischen Übertragung beeinträchtigte die cLTM-Wiedergewinnung in NP1004-Gal4; UAS-Shits fliegt (Abb. 4b). Zur Bestätigung dieser Beobachtung unterdrückte die Blockade der synaptischen Übertragung in AMMC-Neuronen, die mit R38E07-Gal4 und NP0761-Gal4 markiert waren, auch die cLTM-Wiedergewinnung (Fig. 4c und ergänzende Fig. 4c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Darstellung mechanosensorischer Informationen in AMMC-LH-Neuronen für die cLTM-Suche entscheidend ist. Um diese Schlussfolgerung weiter zu bestätigen, blockierten wir nach dem Training mechanosensorische Eingaben durch Entfernen von Arista, einem wichtigen mechanosensorischen Organ in Drosophila. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Behandlung die cLTM beeinträchtigte (4d), jedoch keinen Einfluss auf das Lernen hatte (ergänzende 4d), was auf eine Rolle der AMMC-LH-Neuronen in der cLTM hinweist. Als nächstes bildeten wir die Calciumantworten in ab das LH-Terminal von AMMC-LH-Neuronen nach mechanosensorischem Stimulus, der mit einem winzigen Pinsel auf den Arista aufgetragen wurde (siehe Abschnitt Methoden). Zu diesem Zweck exprimierten wir GCamP6f, ein calciumempfindliches fluoreszierendes Protein50, das von NP1004-Gal4 gesteuert wird. Wir haben dann die Fluoreszenz von GCamP6f aus den LH-Regionen aufgezeichnet (Fig. 4e). Es gab robuste Reaktionen auf den Arista-Kontakt mit der Bürste in der LH-Region, was die Annahme stützt, dass mechanosensorische Informationen über AMMC-LH-Neuronen an die LH weitergeleitet werden.

Um zu bestätigen, dass diese Beobachtungen verhaltensrelevant waren, haben wir überwacht AMMC-neuronale Aktivität unter Verwendung des Transkriptionsreporters von intrazellulärem Calcium (TRIC) 51, der die GFP-Expression proportional zu den intrazellulären Calciumspiegeln in Fliegen erhöht. Die Fluoreszenz von TRIC aus der AMMC-Region wurde 3 h nach dem Wiederauffinden berechnet und auf Kontrollfliegen normalisiert (Fig. 4f). In der AMMC wurde nach kontextabhängigem Abruf ein signifikant größeres TRIC-Signal beobachtet als in den Kontrollfliegen oder nach kontextunabhängigem Abruf, was zeigt, dass die neuronale Aktivität von AMMC gut mit dem kontextabhängigen Abruf korreliert. Somit sind LH-Neuronen in der Lage, mechanosensorische Informationen aus der AMMC und olfaktorische Informationen aus der AL zu integrieren, um cLTM abzurufen (4g).

Die multisensorische Integration in die LH liegt dem cLTM-Abruf zugrunde.

Anschließend haben wir weiter überprüft, ob auch andere sensorische Systeme an diesem Prozess beteiligt waren, beispielsweise das visuelle System. Wir blockierten die visuelle Eingabe durch gezielte Expression von temperaturempfindlichen mutierten Shits in Augen (UAS-Shits; GMR-Gal4) und den Neuronen des optischen Lappens (UAS-Shits; R82D10-Gal4) während der cLTM-Gewinnung (ergänzende 6a). cLTM wurden in beiden Fällen abgeschafft, was darauf hindeutet, dass das visuelle System auch am cLTM-Abruf beteiligt ist.

Solche visuellen Eingaben sowie andere potenzielle sensorische Eingaben konvergieren angeblich zu LH-Neuronen, genau wie im Fall der Mechanosensorik Eingang. Wir führten eine gezielte Expression des präsynaptischen Markers syt :: GFP in verfügbaren Gal4-Linien durch und markierten die folgenden LH-Neuronen, überlegenes mediales Protocerebrum gegenüber LH (smpr-LH; MZ671-Gal4), überlegenes laterales Protocerebrum (relevant für Geschmack52) gegenüber LH (slpr -LH; NP3060-Gal4) und ventrales laterales mediales Protozerebrum (relevant für visual33) bis LH (vlpr-LH; NP5194-Gal4) 25. Die Ergebnisse zeigten, dass sich Projektionen von Zielhirnregionen in der LH-Region versammeln oder Synapsen bilden (Abb. 5a), was darauf hindeutet, dass verschiedene Kontextinformationen an die LH weitergeleitet werden.

Wir haben dann die Auswirkungen der Manipulation der markierten Neuronen auf den cLTM-Abruf getestet. Das Blockieren der synaptischen Übertragung jeder Untergruppe von LH-Neuronen hob das cLTM-Abrufen auf (Fig. 5b und ergänzende Fig. 5). Der cLTM-Abruf wurde jedoch nicht durch die Blockade von MB-Ausgangsneuronen (MB-V2, markiert mit NP2492-Gal4) beeinflusst, die zum LH projizieren, was für traditionelles LTM53 als erforderlich gemeldet wurde. Diese Verbindung kann erforderlich sein, um ein kontextunabhängiges aversives olfaktorisches Gedächtnis abzurufen53,54. Daher beinhaltet das Abrufen von cLTM auch die Integration von synaptischen Eingaben aus anderen unterschiedlichen sensorischen Hirnregionen in das LH (5c).

Um festzustellen, ob diese LH-Neuronen auch am Abrufen des traditionellen LTM beteiligt sind, haben wir blockiert diese Neuronen während des Wiederauffindens nach dem Abstandstraining. Eine solche Blockade hatte keinen Einfluss auf LTM (ergänzende 5b).

Um eine Rolle von LH-Neuronen beim Abrufen von cLTM weiter zu validieren, haben wir dann die Auswirkungen der Blockierung von LH-Ausgangsneuronen getestet. Eine Anzahl von Gal4-Stämmen wird identifiziert, um LH-Ausgangsneuronen zu markieren44. Das 24-Stunden-cLTM war nicht offensichtlich, wenn die Ausgabe von Neuronen, die mit PV5b3, AD1d1, AV4b4 / c1, PV5g1 / g2 oder AV6b1 markiert waren, blockiert war (ergänzende 5c), während AD1e1 und AV6a1 dies nicht waren. Diese Beobachtungen zeigen, dass LH eine zentrale Rolle beim Abrufen von cLTM spielt.

Ausgehend von den Daten, die zusammen mit der berichteten Studie über kontextunabhängige Speicherkomponenten präsentiert wurden, wird vorgeschlagen, ein Modell für das Abrufen von cLTM und LTM vorzuschlagen (Abb 6). Durch die multisensorische Integration in die LH-Gates ist die Abrufbarkeit von cLTM bei konditioniertem Geruch allein ausreichend, um kontextunabhängige Speicher abzurufen.