Horne forlot skolen som 16-åring for å støtte sin syke mor og ble danser ved Cotton Club i Harlem, New York City. I to år på Cotton Club dukket hun opp med slike underholdere som Cab Calloway og spilte til slutt i sine egne show. I 1935 ble hun med i Noble Sissle-orkesteret under navnet Helena Horne. Horne ble gift fra 1937 til 1944 med Louis J. Jones. På begynnelsen av 1940-tallet ble hun ansatt for å synge for Charlie Barnets orkester. Hun ble oppdaget av produsent John Hammond, og kort tid etter opptrådte hun i et soloshow i Carnegie Hall i New York City.

I 1942 flyttet Horne til Los Angeles, hvoretter hun dukket opp i slike filmer som Cabin in the Sky (1943), Meet Me in Las Vegas (1956), og The Wiz (1978). Hennes rolle i filmen Stormy Weather (1943) inkluderte gjengivelsen av tittelsangen, som ble hennes varemerke. En bemerkelsesverdig karismatisk underholder, Horne var en av de mest populære sangerne i sin tid. Et av albumene hennes, Lena Horne på Waldorf-Astoria (1957), var en langvarig bestselger, og hennes første kjente forestilling på Broadway – i musikalen Jamaica (1957) – vant henne en New York Drama Critics ‘Poll Award i 1958 .

Selv om Horne først og fremst var kjent som en entertainer, var hun også kjent for sitt arbeid med sivile rettigheter og politiske organisasjoner, som skuespillerinne nektet hun å spille roller som stereotype afroamerikanske kvinner. Hun var gift med Lennie Hayton fra 1947 til han døde i 1971. Hennes en-kvinneshow, Lena Horne: The Lady and Her Music (1981) , høstet mange priser, inkludert Drama Critics ‘C ircle Award og en spesiell prestasjon Tony Award. I 1984 mottok Horne en Kennedy Center-ære for livstidens bidrag til kunsten, og i 1989 fikk hun en Grammy-pris for livstidsprestasjon.