Horne verliet de school op 16-jarige leeftijd om haar zieke moeder te ondersteunen en werd danseres in de Cotton Club in Harlem, New York City. In twee jaar tijd bij de Cotton Club trad ze op met entertainers als Cab Calloway en speelde ze uiteindelijk in haar eigen shows. In 1935 sloot ze zich aan bij het Noble Sissle-orkest onder de naam Helena Horne. Horne was van 1937 tot 1944 getrouwd met Louis J. Jones. Begin jaren veertig werd ze aangenomen om te zingen voor het orkest van Charlie Barnet. Ze werd ontdekt door producer John Hammond en kort daarna trad ze op in een solotentoonstelling in Carnegie Hall in New York City.

In 1942 verhuisde Horne naar Los Angeles, waarna ze in films als Cabin in the Sky (1943), Meet Me in Las Vegas (1956) en The Wiz (1978). Haar rol in de film Stormy Weather (1943) omvatte haar vertolking van het titelnummer, dat haar handelsmerk werd. Horne, een opmerkelijk charismatische entertainer, was een van de meest populaire zangers van haar tijd. Een van haar albums, Lena Horne in het Waldorf-Astoria (1957), was al lang een bestseller, en haar eerste optreden op Broadway – in de musical Jamaica (1957) – leverde haar in 1958 een New York Drama Critics ‘Poll Award op. .

Hoewel Horne vooral bekend stond als een entertainer, stond ze ook bekend om haar werk met burgerrechten en politieke organisaties; als actrice weigerde ze rollen te spelen die stereotiepe Afro-Amerikaanse vrouwen waren. Ze was getrouwd met Lennie Hayton van 1947 tot aan zijn dood in 1971. Haar one-woman-show, Lena Horne: The Lady and Her Music (1981) , won vele prijzen, waaronder een Drama Critics ‘C ircle Award en een speciale Tony Award. In 1984 ontving Horne een Kennedy Center-onderscheiding voor haar levenslange bijdrage aan de kunsten en in 1989 ontving ze een Grammy Award voor haar hele leven.