Horne forlod skolen i en alder af 16 år for at hjælpe med at støtte sin syge mor og blev danser på Cotton Club i Harlem, New York City. I to år på Cotton Club dukkede hun op med sådanne entertainere som Cab Calloway og til sidst medvirkede i sine egne shows. I 1935 sluttede hun sig til Noble Sissle-orkestret under navnet Helena Horne. Horne blev gift fra 1937 til 1944 med Louis J. Jones. I begyndelsen af 1940’erne blev hun hyret til at synge for Charlie Barnets orkester. Hun blev opdaget af producenten John Hammond, og kort efter optrådte hun i et soloshow i Carnegie Hall i New York City.

I 1942 flyttede Horne til Los Angeles, hvorefter hun optrådte i film som Cabin in himlen (1943), Meet Me in Las Vegas (1956) og The Wiz (1978). Hendes rolle i filmen Stormy Weather (1943) omfattede hendes gengivelse af titelsangen, som blev hendes varemærke. En bemærkelsesværdig karismatisk entertainer, Horne var en af de mest populære sangere i sin tid. Et af hendes album, Lena Horne på Waldorf-Astoria (1957), var en langvarig bestseller, og hendes første optræden på Broadway – i musicalen Jamaica (1957) – vandt hende en New York Drama Critics ‘Poll Award i 1958 .

Selvom Horne primært var kendt som entertainer, blev Horne også kendt for sit arbejde med borgerrettigheder og politiske organisationer; som skuespillerinde nægtede hun at spille roller, der stereotype afroamerikanske kvinder. Hun var gift med Lennie Hayton fra 1947 til sin død i 1971. Hendes en-kvindeshow, Lena Horne: The Lady and Her Music (1981) , fik mange priser, herunder en Drama Critics ‘C ircle Award og en særlig præstation Tony Award. I 1984 modtog Horne en Kennedy Center-ære for livstidens bidrag til kunsten, og i 1989 fik hun en Grammy-pris for livstidspræstation.