Desenho do ensaio

O estudo foi um ensaio duplo-cego (randomizado balanceado, um: um) controlado por placebo entre mães grávidas positivas para HSV-2 atendidas na clínica pré-natal no Hospital Mulago, Uganda, de janeiro de 2014 a fevereiro de 2015.

Cenário do estudo

O ensaio foi conduzido na clínica pré-natal para mulheres de alto risco, na enfermaria pré-natal e na enfermaria do parto no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia do Hospital Mulago, Uganda. O Mulago Hospital serve como hospital universitário da Makerere University Medical School e também como Hospital Nacional de Referência de Uganda. O hospital atende cerca de 4.000 mulheres no pré-natal e dá à luz cerca de 2.000 mulheres por mês. Mais de 90% das mulheres grávidas em Uganda agendam o pré-natal, mas apenas 50% delas comparecem às quatro consultas exigidas. A mediana da idade gestacional de reserva para atendimento pré-natal é de 20 semanas de gestação.

O tratamento da PROM em qualquer idade gestacional no Hospital Mulago começa com o diagnóstico. As mulheres geralmente se queixam de drenagem ou jato de líquido da vagina antes do início do trabalho de parto. O diagnóstico de PROM é feito no exame do espéculo se houver observação de acúmulo de líquido no fórnice vaginal posterior ou fluxo livre de líquido do colo do útero. Todas as mulheres com PROM são admitidas. Antibióticos são administrados (Eritromicina 500 mg 6 horas por via oral ou Ampicilina 1 g 12 horas por via intravenosa ou uma cefalosporina por via intravenosa ± se secreção fétida – metronidazol 500 mg 8 horas por via intravenosa). A mãe e o feto são avaliados quanto à infecção: temperatura, pulso, sensibilidade sobre o útero, cor alterada do líquido, hemograma completo e obtenção de amostras para culturas, se indicado (febre, leucocitose, mau cheiro ou corrimento de cor alterado). Os exames vaginais digitais são evitados até que a indução seja indicada ou como parte do monitoramento durante a fase ativa do parto. Se o feto está morto em qualquer idade gestacional e não há contra-indicações para parto vaginal, a indução do parto é realizada imediatamente. Se houver contra-indicação para parto vaginal (dois ou mais P / S ou cirurgia de formiga uterina, má apresentação, mau posicionamento, placenta prévia), então uma cesariana é realizada. Se o bebê está vivo para uma mãe com PROM a termo sem contra-indicação para parto vaginal, a indução do parto é realizada. Se a mulher tiver contra-indicação para parto vaginal, então uma cesariana é realizada.

Mulheres com PROM em gestações acima de 28 semanas até 36 semanas com feto vivo recebem esteroides para promover a maturação dos pulmões fetais dexametasona muscular 12 mg 12 horas por 24 horas). O parto é então indicado para mulheres com PROM em gestações acima de 34 semanas até 36 semanas.

Para mulheres com PROM entre 28 e 34 semanas, a conduta expectante associada ao monitoramento do bem-estar materno e fetal na enfermaria é em seguida, feito até 34 semanas, desde que não haja suspeita de infecção intrauterina. Um ultrassom é feito para avaliação da posição fetal, estado cervical e volume de fluido uma vez por semana. Os antibióticos são continuados por 5 dias. A vigilância para infecção continua e, se ocorrer infecção, antibióticos intravenosos são administrados e o parto é indicado. A indução ou cesariana é feita de acordo com a avaliação do obstetra de plantão.

Após o parto, os antibióticos são administrados por 24 horas em pacientes que não apresentam evidência de infecção. Nas mulheres com evidência de infecção, os antibióticos são continuados por 5 dias. Os bebês são monitorados quanto à infecção e levados para a unidade de cuidados neonatais se houver evidência de infecção.

Participantes do estudo

Triagem para o seroestado para HSV-2

Triamos mulheres consentidas entre 20 e 26 semanas de gestação para o status sorológico para HSV-2, conforme determinado pelo HerpeSelect HSV-2 ELISA (Focus Diagnostics, CA, EUA). Dois mililitros (ml) de sangue foram retirados de cada participante do estudo em vacutainers simples (BD, Biosciences) e transportados para o laboratório de testes, isto é, Laboratório de Imunologia na Makerere University College of Health Sciences. No laboratório, um ml de soro foi recuperado no mesmo dia e armazenado a 2–8 ° C quando os testes ELISA deveriam ser feitos dentro de 48 h ou a −80 ° C para as amostras que deveriam ser testadas posteriormente no momento de realizando o teste, as amostras de soro armazenadas foram colocadas na mesa de trabalho por cerca de 1 hora para trazê-las à temperatura ambiente. Um décimo do soro foi misturado com 100 microlitros de diluente de amostra antes de ser testado para HSV-2 IgG seguindo as instruções do fabricante.O HerpeSelect HSV-2 ELISA tem uma sensibilidade de 96–97% e uma especificidade de 98% de acordo com o fabricante. Consideramos a densidade óptica de corte de 3,5 e acima como positiva e abaixo dela como negativa, como tem sido a prática em estudos recentes em nosso meio, seguindo estudos de sensibilidade e especificidade.

Critérios de inclusão e exclusão no estudo

Incluímos mulheres grávidas soropositivas para HSV-2 com idade entre 18 e 43 anos na 28ª semana de gestação, em qualquer parto e atendendo à clínica de cuidados pré-natais do Hospital Mulago. Vinte e oito semanas é a idade mais baixa de viabilidade fetal de acordo com as diretrizes do Ministério da Saúde de Uganda (Diretrizes de Cuidados Clínicos para Cuidados Maternos e Neonatais Essenciais para Uganda, julho de 2009). Pelo menos um em cada dois bebês nascidos com 28 semanas ou após sobrevive sem complicações por muito tempo em Uganda. Excluímos uma mulher que apresentava lesões herpéticas genitais ativas (precisava de uma dose mais elevada de ACV) e uma outra mulher que apresentava alta carga de medicamentos (tinha tratamento para HIV e diabetes). Também não incluímos aqueles que retornaram após 28 semanas.

Intervenções

Os participantes inscritos foram designados aleatoriamente em uma proporção de um para um para tomar 400 mg de aciclovir oral duas vezes ao dia ou correspondência placebo de 28 semanas até 36 semanas completas usando números aleatórios gerados por computador. Os participantes foram instruídos a tomar os comprimidos por via oral diariamente e trazer os comprimidos restantes de volta na próxima visita.

Semelhança da intervenção

O aciclovir foi comprado na farmácia Laborex, que foi licenciada para vender medicamentos em Uganda e estava na lista de compras da Makerere University. O aciclovir já foi aprovado pela Autoridade Nacional de Medicamentos (NDA) e pode ser usado se indicado em mulheres grávidas após o primeiro trimestre. O placebo foi um comprimido simples contendo glicolato de amido sódico, estearato de magnésio e amido de milho com revestimento branco formulado para ter uma aparência externa semelhante aos comprimidos de aciclovir. Ambos os medicamentos foram embalados pela Kampala Pharmaceuticals Industry (KPI) Limited em recipientes semelhantes indistinguíveis, exceto pelo rótulo de números aleatórios.

Randomização

Um farmacêutico do KPI alocou o aciclovir ou placebo usando o lista aleatória gerada por computador. A sequência de randomização foi produzida usando um randomizador de pesquisa online na proporção de 1: 1 por um estatístico que não participou do estudo. A alocação foi tal que cada participante foi inscrito e recebeu um número de estudo dos assistentes de pesquisa. Os participantes foram então escoltados para a seção designada da farmácia do estudo, onde um envelope correspondente foi aberto. Esse envelope tinha um código aleatório que correspondia ao código em um recipiente de medicamento correspondente, que era então entregue ao cliente para tomar diariamente.

Cálculo do tamanho da amostra

O tamanho da amostra para este estudo foi determinado para o resultado primário de ruptura prematura de membranas pré-termo (Pré-PROM) usando a calculadora online de tamanho de amostra Open Epi. A fórmula foi embasada pela fórmula de Fleiss para determinar o tamanho da amostra em estudos comparativos em que o resultado é uma proporção (Fleiss et al. 1980), (Métodos Estatísticos para Taxas e Proporções, fórmulas 3.18 & 3,19. A proporção de PROM sem intervenção foi de 12%, que era a proporção de pacientes com PROM diariamente na enfermaria de parto de acordo com os registros departamentais de 2012. A proporção esperada do resultado no grupo de intervenção foi considerada como 1,2% (uso de aciclovir redução da excreção genital de 34-37% para 2-4%, o que era mais de 90% de redução). O estudo usou intervalo de confiança de 95% e poder de 80%. O tamanho da amostra calculado foi de 83 em cada um dos braços. Adicionamos um valor antecipado 20% (17 participantes para cada braço) como perda de acompanhamento, resultando em 100 mulheres nos braços de aciclovir e 100 nos braços de placebo.

Procedimento de amostragem

Para obter a amostra necessária , uma abordagem de amostragem consecutiva para mães grávidas que atenderam aos critérios de inclusão foi feito até que a amostra necessária fosse realizada.

Cegamento

O pesquisador, os assistentes de pesquisa e os participantes não sabiam o que o participante estava recebendo (aciclovir ou placebo). Apenas o farmacêutico (quem fez a embalagem) e o estatístico (com a folha de randomização) sabiam o que estava embalado.

Resultados

O resultado primário foi o desenvolvimento de ruptura prematura de membranas antes ou em trinta e seis semanas completas. Os desfechos secundários foram parto prematuro, sepse materna, puerperal, eliminação do HSV-2 genital a termo, morte fetal, baixo peso ao nascer, baixo índice de Apgar (abaixo de 7 em 5 min), admissão em unidade de cuidados especiais neonatais e efeitos colaterais de medicamentos. A PROM foi diagnosticada com base na história de passagem de líquido claro pela vagina e confirmada por exame de espéculo estéril.

Parto prematuro é o nascimento de um bebê antes de 37 semanas completas de gestação.A sepse materno-puerperal é a infecção dos órgãos genitais e do canal do parto desde o momento da ruptura das membranas ou início do trabalho de parto até o final 6 semanas após o parto. As características clínicas da sepse puerperal incluem fuligem por corrimento vaginal, dor abdominal e febre com temperatura de 38,5 ° C. Em nosso estudo, consideramos sepse puerperal como história de corrimento vaginal anormal e febre que notamos após 24 e 72 horas do parto. O baixo peso ao nascer foi considerado como peso de bebês abaixo de 2.500 gramas.

A eliminação genital de HSV-2 a termo foi considerada evidência de DNA de HSV-2 em esfregaço cervical usando PCR feito em 38 semanas em trabalho de parto ou não ou antes em caso de parto prematuro. O procedimento de PCR foi semelhante ao realizado em estudos anteriores. Especificamente, o DNA foi extraído dos cotonetes usando fenol clorofórmio / álcool iso-amílico. O HSV-2 foi então identificado usando primers e sondas que usam o software FluoroType HSV-2, versão 1.0 (Hain LifeScience GmbH, Nehren, Alemanha). Neste método, 6 microlitros de DNA extraído foram adicionados a 10 microlitros de misturas de amplificador (A e B) e uma sonda de fita única que emitia cor quando o DNA de HSV estava nas proximidades (Hain LifeScience GmbH, Nehren, Alemanha). A sonda colorida foi então aquecida por um Fluorocycler® e a intensidade da cor emitida foi então medida enquanto a temperatura subia. As sequências de nucleotídeos herpéticos têm diferentes pontos de fusão que são plotados como curvas. O software detector de sequência interpretou a presença ou ausência de picos dos pontos de fusão correspondentes ao DNA de HSV-2 dando resultados positivos ou negativos, respectivamente (Hain LifeScience GmbH, Nehren, Alemanha).

Os efeitos colaterais da droga avaliados incluíram : visão turva, tontura, sonolência, náusea, vômito, sensibilidade à luz solar, erupção cutânea de hipersensibilidade, febre, alucinações e sangue na urina. Os outros efeitos avaliados foram níveis anormais de hemoglobina, alanina transferase hepática e creatinina no momento da ruptura prematura das membranas ou 38 semanas.

As variáveis independentes incluíram características sociodemográficas (idade, estado civil, nível mais alto da escolaridade alcançada, ocupação e paridade); história obstétrica, como história pregressa de ruptura prematura de membranas, status de HIV obtido de registros hospitalares pré-natais e candidíase concomitante e Trichomonas vaginalis.

Procedimentos de estudo e acompanhamento

Bases sociodemográficas e obstétricas os dados foram coletados e registrados em formulários de relato de caso administrados por entrevistadores para os participantes inscritos por parteiras que foram treinadas nos procedimentos de pesquisa. A sorologia para HIV foi obtida nos registros pré-natais. Um exame obstétrico foi feito seguido por um exame pélvico e, em seguida, dois esfregaços vaginais foram retirados para candidíase e Trichomonas vaginalis. Quatro mililitros de sangue foram coletados para função renal, funções hepáticas e hemograma completo.

As visitas do estudo foram realizadas às 32, 36, 38 semanas e ao parto. A visita de 32 semanas foi 4 semanas após a inscrição e serviu como atendimento pré-natal de rotina de acordo com as diretrizes do Ministério da Saúde e para recarga do medicamento do estudo com código aleatório semelhante. Na visita de 36 semanas, o seguinte foi realizado: cuidados pré-natais, revisão na conclusão do período do estudo de intervenção randomizado e administração de aciclovir supressor de rotina. Durante as visitas de 32 e 36 semanas, a adesão aos medicamentos e as queixas foram avaliadas. A conformidade foi medida por autorrelato da duração da medicação do estudo foi tomada. Além disso, quaisquer medicamentos concomitantes foram anotados e documentados. Além disso, investigações relevantes foram feitas. Todos os pacientes receberam ferro e ácido fólico para ingestão oral. Além disso, Sulphadoxina / pirimetamina (FansidarTM) para prevenção da malária foi administrada de acordo com as diretrizes do Ministério da Saúde de Uganda (Diretrizes de Cuidados Clínicos para Cuidados Maternos e Neonatais Essenciais para Uganda, julho de 2009). Para todas as participantes, a documentação relevante foi feita em cada visita.

As mulheres que desenvolveram PROM receberam antibióticos e foram tratadas de acordo com o protocolo do hospital adaptado da Sociedade de obstetras e ginecologistas do Canadá. As queixas de febre e corrimento vaginal anormal foram avaliadas 24 e 72 horas após o parto. Além disso, morte fetal, baixo peso ao nascer, índice de Apgar e admissão na unidade de cuidados especiais neonatais também foram registrados nos formulários pertinentes. Coletamos esfregaços cervicais para PCR de HSV-2 DNA em 38 semanas / ou antes disso, se o participante tivesse parto prematuro ou ruptura de membranas. Para as mulheres que faltaram à consulta de 38 semanas, fizemos o esfregaço cervical em qualquer momento em que entraram em trabalho de parto. O hemograma completo e os testes de função renal e hepática foram repetidos na consulta de encerramento. Todas as reclamações foram registradas em um formulário de eventos adversos. Os eventos adversos graves (EAGs) foram predeterminados como: admissão do bebê na unidade neonatal por mais de 24 horas, óbito fetal, mais readmissão da mãe durante o puerpério ou morte materna.Os SAEs deveriam ser registrados em um formulário adverso grave, mas não recebemos nenhum. Quaisquer medicamentos prescritos e dispensados aos participantes foram registrados no registro de medicamentos concomitantes.

Gerenciamento de dados, controle de qualidade e análise estatística

Todos os assistentes de pesquisa tiveram treinamento em conduta ética de pesquisa, o processo de consentimento e coleta de dados uma semana anterior ao estudo. Houve também reuniões semanais de estudo para avaliar o progresso das inscrições e os desafios enfrentados. Um treinamento de atualização relevante foi feito conforme a necessidade surgia. Os questionários foram testados. Laboratórios acreditados foram usados para investigações de estudo. Os dados foram checados diariamente quanto à exaustividade pelo médico plantonista e pelo pesquisador principal. As dúvidas foram levantadas diariamente e resolvidas. A dupla entrada de dados foi feita por meio do programa EPI-INFO. Os dados foram então exportados para o STATA versão 12 (Stata Corp., College Station, TX, EUA) para análise.

Um Conselho de Monitoramento de Dados e Segurança (DSMB) independente foi estabelecido para supervisionar a segurança e o progresso do tentativas. Se um evento adverso sério (readmissão materna ou fetal ou morte) ocorresse, deveria ser relatado dentro de 24 horas ao DSMB e, em seguida, ao HDREC e ao UNCST. Nenhum dos participantes relatou um evento adverso sério, portanto, nenhum relatório de SAE foi feito.

Análise e revisão provisória pelo DSMB

A análise provisória foi feita quando acumulamos dados de 30% do tamanho da amostra (60 participantes). Não houve relatos de eventos adversos graves em nenhum dos braços. Não houve diferenças no braço de aciclovir em comparação com o braço de controle no que diz respeito a resultados adversos, então o estudo foi continuado até a conclusão.

A análise de intenção de tratar foi usada. Todos os participantes randomizados foram incluídos na análise e mantidos no grupo ao qual foram alocados. O desfecho primário foi o desenvolvimento de ruptura de membranas em 36 semanas.

Estatística descritiva

Os dados categóricos para intervenção e grupos de placebo foram resumidos como contagens e proporções, enquanto variáveis contínuas, como idade, foram resumidas usando média e desvios padrão.

Análise bivariada

A comparação entre os grupos de intervenção e o grupo placebo com base nas características basais foi feita. O cálculo e a comparação da incidência de PROM por 36 semanas completas no aciclovir, braço de placebo foram feitos usando taxas de risco, e a significância das taxas de risco foi avaliada pelos valores p e intervalos de confiança de 95%.

O cálculo e a comparação da porcentagem de pacientes que desenvolveram desfechos secundários no grupo de intervenção e no grupo placebo foram feitos usando taxas de risco e a significância das taxas de risco foi avaliada pelos valores de p e intervalos de confiança de 95%.

Consideração ética

A aprovação ética para o protocolo do estudo, formulários de relato de caso e formulários de consentimento foi obtida do Comitê de Ética e Pesquisa da Faculdade de Ciências da Saúde da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade Makerere e do Conselho Nacional de Ciência de Uganda e Tecnologia (número de aprovação HS 1413). Obtivemos consentimento informado por escrito de todos os participantes que foram selecionados e inscritos. Todos os participantes receberam educação em saúde sobre a prevenção do HSV-2. Todas as participantes que atingiram 36 semanas de gestação receberam aciclovir para evitar que seus bebês adquirissem HSV-2 no período perinatal. Os dados coletados continham informações sensíveis sobre as práticas sexuais, portanto, o sigilo foi observado em toda a documentação do estudo. Os registros foram colocados sob dupla fechadura e chave. Os dados continham as iniciais dos participantes e não os nomes.