structuren / ECOD

RCSB PDB; PDBe; PDBj

structuuroverzicht

structuren / ECOD

RCSB VOB; PDBe; PDBj

structuuroverzicht

structuren / ECOD

VOB

RCSB VOB; PDBe; PDBj

structuuroverzicht

Op basis van sequentiehomologie kunnen DNA-polymerasen verder worden onderverdeeld in zeven verschillende families: A, B, C, D, X, Y, en RT.

Sommige virussen coderen ook voor speciale DNA-polymerasen, zoals DNA-polymerase van het hepatitis B-virus. Deze kunnen viraal DNA selectief repliceren via een verscheidenheid aan mechanismen. Retrovirussen coderen voor een ongebruikelijk DNA-polymerase genaamd reverse transcriptase, een RNA-afhankelijke DNA-polymerase (RdDp). Het polymeriseert DNA uit een sjabloon van RNA.

Prokaryote polymeraseEdit

Prokaryote polymerasen bestaan in twee vormen: kernpolymerase en holoenzym. Kernpolymerase synthetiseert DNA uit de DNA-template, maar kan de synthese niet alleen of nauwkeurig initiëren. Holoenzyme initieert nauwkeurig de synthese.

Pol IEdit

Prokaryotische familie A-polymerasen omvatten het DNA-polymerase I (Pol I) -enzym, dat wordt gecodeerd door het polA-gen en alomtegenwoordig is onder prokaryoten. Dit reparatiepolymerase is betrokken bij excisieherstel met zowel 3 “–5” als 5 “–3” exonucleaseactiviteit en de verwerking van Okazaki-fragmenten die worden gegenereerd tijdens de synthese van achterblijvende streng. Pol I is het meest voorkomende polymerase, goed voor > 95% van de polymerase-activiteit in E. coli; toch is gevonden dat cellen die Pol I missen, suggereren dat Pol I-activiteit kan worden vervangen door de andere vier polymerasen. Pol I voegt ~ 15-20 nucleotiden per seconde toe, en vertoont dus een slechte processiviteit. In plaats daarvan begint Pol I nucleotiden toe te voegen aan de RNA-primer: template-junctie die bekend staat als de oorsprong van replicatie (ori). Ongeveer 400 bp stroomafwaarts van de oorsprong, wordt het Pol III holoenzym geassembleerd en neemt de replicatie over met een zeer verwerkingssnelheid en aard.

Taq-polymerase is een hittestabiel enzym van deze familie dat geen proefleesvermogen heeft. / p>

Pol IIEdit

DNA-polymerase II is een familie B-polymerase gecodeerd door het polB-gen. Pol II heeft 3 “–5” exonuclease-activiteit en neemt deel aan DNA-herstel, replicatie herstart om laesies te omzeilen, en zijn celaanwezigheid kan tijdens SOS-inductie van ~ 30-50 kopieën per cel naar ~ 200-300 springen. Pol II wordt ook beschouwd als een back-up van Pol III omdat het kan interageren met holo-enzymeiwitten en een hoge mate van processiviteit aannemen. Aangenomen wordt dat de belangrijkste rol van Pol II het vermogen is om de polymerase-activiteit op de replicatievork te richten en het hielp om Pol III-bypass-terminale mismatches tot stilstand te brengen.

Pfu DNA-polymerase is een hittestabiel enzym van deze familie dat wordt aangetroffen in de hyperthermofiele archaeon Pyrococcus furiosus. Gedetailleerde classificatie verdeelt familie B in archaea in B1, B2, B3, waarin B2 een groep pseudo-enzymen is. Pfu behoort tot familie B3. Andere PolBs gevonden in archaea maken deel uit van “Casposons”, Cas1-afhankelijke transposons. Sommige virussen (inclusief Φ29 DNA-polymerase) en mitochondriale plasmiden dragen ook polB.

Pol IIIEdit

DNA-polymerase III holoenzym is het primaire enzym dat betrokken is bij DNA-replicatie in E. coli en aan familie C-polymerasen. Het bestaat uit drie assemblages: de pol III-kern, de beta-glijdende klemprocessiviteitsfactor en het klemlaadcomplex. De kern bestaat uit drie subeenheden: α, de polymerase-activiteitshub, ɛ, exonucleolytische proeflezer, en θ, die kan dienen als een stabilisator voor ɛ. De verwerkingsfactor van de bèta-glijdende klem is ook in tweevoud aanwezig, één voor elke kern, om een klem te creëren die het DNA omhult en een hoge verwerkbaarheid mogelijk maakt. Het derde samenstel is een zeven-subeenheid (τ2γδδ′χψ) klemladercomplex.

Het oude leerboek “trombonemodel” toont een verlengingscomplex met twee equivalenten van het kernezym bij elke replicatievork (RF), één voor elke streng, de achterblijvende en leidende. Recent bewijs van onderzoeken met één molecuul duidt echter op een gemiddelde van drie stoichiometrische equivalenten kernenzym bij elke RF voor zowel Pol III als zijn tegenhanger in B. subtilis, PolC.In-cel fluorescentiemicroscopie heeft aangetoond dat de leidende strengsynthese mogelijk niet volledig continu is, en Pol III * (dwz de holoenzym α, ε, τ, δ en χ subeenheden zonder de ß2-glijdende klem) een hoge dissociatie van actieve RFs. In deze onderzoeken was de omloopsnelheid van de replicatievork ongeveer 10s voor Pol III *, 47s voor de ß2-schuifklem en 15m voor de DnaB-helicase. Dit suggereert dat de DnaB-helicase stabiel geassocieerd kan blijven bij RF’s en kan dienen als een nucleatiepunt voor het competente holoenzym. In-vitro-onderzoeken met één molecuul hebben aangetoond dat Pol III * een hoge mate van RF-omzetting heeft wanneer deze te hoog is, maar stabiel geassocieerd blijft met replicatievorken wanneer de concentratie beperkt is. Een ander onderzoek met één molecuul toonde aan dat DnaB-helicase-activiteit en strengverlenging kunnen plaatsvinden met ontkoppelde, stochastische kinetiek.

Pol IVEdit

In E. coli is DNA-polymerase IV (Pol IV) een foutgevoelige DNA-polymerase die betrokken is bij niet-gerichte mutagenese. Pol IV is een familie Y-polymerase dat tot expressie wordt gebracht door het dinB-gen dat wordt ingeschakeld via SOS-inductie veroorzaakt door vastgelopen polymerasen bij de replicatievork. Tijdens SOS-inductie wordt de Pol IV-productie vertienvoudigd en een van de functies gedurende deze tijd is om de Pol III-holoenzymprocessiviteit te verstoren. Dit creëert een controlepunt, stopt de replicatie en geeft tijd om DNA-laesies te herstellen via de juiste herstelroute. Een andere functie van Pol IV is het uitvoeren van translesiesynthese bij de vastgelopen replicatievork, zoals bijvoorbeeld het omzeilen van N2-deoxyguanine-adducten met een hogere snelheid dan het transverseren van onbeschadigd DNA. Cellen zonder dinB-gen hebben een hogere mutagenese veroorzaakt door DNA-beschadigende stoffen.

Pol VEdit

DNA-polymerase V (Pol V) is een Y-familie DNA-polymerase dat betrokken is bij SOS-respons en translesiesynthese DNA-herstelmechanismen. Transcriptie van Pol V via de umuDC-genen wordt sterk gereguleerd om alleen Pol V te produceren wanneer beschadigd DNA in de cel aanwezig is en een SOS-respons genereert. Vastgelopen polymerasen zorgen ervoor dat RecA bindt aan het ssDNA, waardoor het LexA-eiwit automatisch verteert. LexA verliest dan zijn vermogen om de transcriptie van het umuDC-operon te onderdrukken. Hetzelfde RecA-ssDNA-nucleoproteïne modificeert het UmuD-eiwit posttranslationeel in het UmuD-eiwit. UmuD en UmuD vormen een heterodimeer dat een interactie aangaat met UmuC, dat op zijn beurt de katalytische activiteit van umuC op beschadigd DNA activeert. In E. coli, een polymerase. tool belt ”-model voor het wisselen van pol III met pol IV bij een vastgelopen replicatievork, waarbij beide polymerasen gelijktijdig aan de β-klem binden, is voorgesteld. De betrokkenheid van meer dan één TLS-polymerase die achter elkaar werken om een laesie te omzeilen, is echter nog niet aangetoond in E. coli. Bovendien kan Pol IV zowel insertie als extensie met hoge efficiëntie katalyseren, terwijl pol V wordt beschouwd als de belangrijkste SOS TLS-polymerase. Een voorbeeld is de bypass van intra-streng guanine-thymine-crosslink, waarbij op basis van het verschil in de mutatiesignaturen van de twee polymerasen werd aangetoond dat pol IV en pol V strijden om TLS van de intra-streng crosslink.

Familie DEdit

In 1998 werd de familie D van DNA-polymerase ontdekt in Pyrococcus furiosus en Methanococcus jannaschii. Het PolD-complex is een heterodimeer van twee ketens, elk gecodeerd door DP1 (kleine proeflezing) en DP2 (grote katalytische). In tegenstelling tot andere DNA-polymerasen, lijken de structuur en het mechanisme van de DP2-katalytische kern op die van RNA-polymerasen met meerdere subeenheden. De DP1-DP2-interface lijkt op die van de eukaryotische zinkvinger van klasse B-polymerase en zijn kleine subeenheid. DP1, een Mre11-achtig exonuclease, is waarschijnlijk de voorloper van een kleine subeenheid van Pol α en ε, en biedt mogelijkheden voor proeflezen die nu verloren zijn gegaan in eukaryoten. Het N-terminale HSH-domein is qua structuur vergelijkbaar met AAA-eiwitten, vooral Pol III-subeenheid δ en RuvB. DP2 heeft een Klasse II KH-domein. Pyrococcus abyssi polD is hittestabieler en nauwkeuriger dan Taq-polymerase, maar is nog niet op de markt gebracht. Er is voorgesteld dat familie D DNA-polymerase de eerste was die evolueerde in cellulaire organismen en dat het replicatieve polymerase van de laatste universele cellulaire voorouder (LUCA) behoorde tot familie D.

Eukaryoot DNA-polymerase Bewerken

Polymerasen β, λ, σ, μ (beta, lambda, sigma, mu) en TdTEdit

Familie X-polymerasen bevatten het bekende eukaryotische polymerase pol β (beta), evenals andere eukaryotische polymerasen zoals Pol σ (sigma), Pol λ (lambda), Pol μ (mu) en Terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT). Familie X-polymerasen worden voornamelijk aangetroffen bij gewervelde dieren, en enkele worden aangetroffen in planten en schimmels. Deze polymerasen hebben sterk geconserveerde gebieden die twee helix-haarspeld-helixmotieven bevatten die noodzakelijk zijn bij de DNA-polymerase-interacties. Eén motief bevindt zich in het 8 kDa-domein dat interageert met stroomafwaarts gelegen DNA en één motief bevindt zich in het duimdomein dat interageert met de primerstreng.Pol β, gecodeerd door het POLB-gen, is vereist voor herstel van basale excisie met een korte patch, een DNA-herstelroute die essentieel is voor het repareren van gealkyleerde of geoxideerde basen en voor abasische plaatsen. Pol λ en Pol μ, gecodeerd door respectievelijk de POLL- en POLM-genen, zijn betrokken bij niet-homologe eindverbinding, een mechanisme voor het opnieuw verbinden van dubbelstrengige DNA-breuken als gevolg van respectievelijk waterstofperoxide en ioniserende straling. TdT komt alleen tot expressie in lymfoïde weefsel, en voegt “n nucleotiden” toe aan dubbelstrengs breuken gevormd tijdens V (D) J-recombinatie om immunologische diversiteit te bevorderen.

Polymerasen α, δ en ε (alfa, delta, en epsilon) Bewerken

Pol α (alfa), Pol δ (delta) en Pol ε (epsilon) zijn leden van Familie B-polymerasen en zijn de belangrijkste polymerasen die betrokken zijn bij nucleaire DNA-replicatie. Pol α-complex (pol α-DNA-primasecomplex) bestaat uit vier subeenheden: respectievelijk de katalytische subeenheid POLA1, de regulerende subeenheid POLA2 en de kleine en de grote primase-subeenheden PRIM1 en PRIM2. Zodra primase de RNA-primer heeft gemaakt, begint Pol α met replicatie en verlengt de primer met ~ 20 nucleotiden. Vanwege zijn hoge processiviteit neemt Pol δ de leidende en achterblijvende strengsynthese over van Pol α.: 218-219 Pol δ wordt tot expressie gebracht door de genen POLD1, waardoor de katalytische subeenheid ontstaat, POLD2, POLD3 en POLD4 die de andere subeenheden creëren die een wisselwerking hebben met Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), een DNA-klem waarmee Pol δ processiviteit kan bezitten. Pol ε wordt gecodeerd door de POLE1, de katalytische subeenheid, POLE2 en POLE3-gen. Er is gerapporteerd dat de functie van Pol ε is om de leidende streng tijdens replicatie uit te breiden, terwijl Pol δ primair de achterblijvende streng repliceert; recent bewijs suggereerde echter dat Pol δ ook een rol zou kunnen spelen bij het repliceren van de leidende DNA-streng. Pol ε “s C-terminus” polymerase relic “-regio, ondanks dat het niet nodig is voor polymerase-activiteit, wordt verondersteld essentieel te zijn voor celvitaliteit. Aangenomen wordt dat het C-terminus-gebied een controlepunt biedt voordat het anafase binnengaat, stabiliteit biedt aan het holoenzym, en voeg eiwitten toe aan het holoenzym dat nodig is voor het initiëren van replicatie. Pol ε heeft een groter “palm” -domein dat een hoge processiviteit biedt onafhankelijk van PCNA.

In vergelijking met andere familie B-polymerasen is de DEDD-exonuclease-familie verantwoordelijk voor proeflezen is geïnactiveerd in Pol α. Pol ε is uniek omdat het twee zinkvingerdomeinen heeft en een inactieve kopie van een ander familie B-polymerase in het C-uiteinde. De aanwezigheid van deze zinkvinger heeft implicaties voor de oorsprong van Eukaryota, die in dit case wordt in de Asgard-groep geplaatst met archaea B3-polymerase.

Polymerases η, ι en κ (eta, iota en kappa) Bewerken

Pol η (eta), Pol ι ( iota) en Pol κ (kappa), zijn familie Y DNA-polymerasen die betrokken zijn bij de D NA-reparatie door translesiesynthese en gecodeerd door respectievelijk genen POLH, POLI en POLK. Leden van familie Y hebben vijf gemeenschappelijke motieven om te helpen bij het binden van het substraat en het primeruiteinde en ze bevatten allemaal de typische rechterduim-, palm- en vingerdomeinen met toegevoegde domeinen zoals pink (LF), polymerase-geassocieerd domein (PAD) of pols. De actieve plaats verschilt echter tussen gezinsleden vanwege de verschillende laesies die worden gerepareerd. Polymerasen in familie Y zijn low-fidelity-polymerasen, maar het is bewezen dat ze meer goed doen dan schade toebrengen, aangezien mutaties die het polymerase beïnvloeden verschillende ziekten kunnen veroorzaken, zoals huidkanker en Xeroderma Pigmentosum Variant (XPS). Het belang van deze polymerasen blijkt uit het feit dat het gen dat codeert voor DNA-polymerase η XPV wordt genoemd, omdat het verlies van dit gen resulteert in de ziekte Xeroderma Pigmentosum Variant. Pol η is vooral belangrijk voor het mogelijk maken van nauwkeurige translesiesynthese van DNA-schade als gevolg van ultraviolette straling. De functionaliteit van Pol κ is niet helemaal duidelijk, maar onderzoekers hebben twee waarschijnlijke functies gevonden. Pol κ wordt verondersteld te werken als een extender of een inserter van een specifieke base bij bepaalde DNA-laesies. Alle drie de translesiesynthesepolymerasen, samen met Rev1, worden gerekruteerd voor beschadigde laesies via vastgelopen replicatieve DNA-polymerasen. Er zijn twee routes van schadeherstel leidende onderzoekers om te concluderen dat de gekozen route afhangt van welke streng de schade bevat, de leidende of achterblijvende streng.

Polymerases Rev1 en ζ (zeta) Bewerken

Pol ζ een andere B-familie polymerase, bestaat uit twee subeenheden Rev3, de katalytische subeenheid, en Rev7 (MAD2L2), die de katalytische functie van het polymerase verhoogt, en is betrokken bij translesiesynthese. Pol ζ mist 3 “tot 5” exonuclease-activiteit, is uniek omdat het primers kan verlengen met terminale mismatches. Rev1 heeft drie interessegebieden in het BRCT-domein, ubiquitine-bindend domein en C-terminaal domein en heeft dCMP-transferase-vermogen, dat deoxycytidine toevoegt tegenover laesies die replicatieve polymerasen Pol δ en Pol ε zouden blokkeren.Deze vastgelopen polymerasen activeren ubiquitinecomplexen die op hun beurt replicatiepolymerasen ontkoppelen en Pol ζ en Rev1 rekruteren. Pol ζ en Rev1 voegen samen deoxycytidine toe en Pol ζ strekt zich uit voorbij de laesie. Door een nog niet bepaald proces, scheidt Pol ζ zich en replicatiepolymerases associëren opnieuw en zetten de replicatie voort. Pol ζ en Rev1 zijn niet vereist voor replicatie, maar verlies van het REV3-gen in ontluikende gist kan een verhoogde gevoeligheid voor DNA-beschadigende stoffen veroorzaken als gevolg van het instorten van replicatievorken waar replicatiepolymerasen zijn vastgelopen.

TelomeraseEdit

Telomerase is een ribonucleoproteïne dat functioneert om uiteinden van lineaire chromosomen te repliceren, aangezien normaal DNA-polymerase de uiteinden of telomeren niet kan repliceren. De enkelstrengs 3 “overhang van het dubbelstrengs chromosoom met de sequentie 5” -TTAGGG-3 “rekruteert telomerase. Telomerase werkt als andere DNA-polymerasen door het 3” -uiteinde te verlengen, maar in tegenstelling tot andere DNA-polymerasen, vereist telomerase geen een sjabloon. De TERT-subeenheid, een voorbeeld van een reverse transcriptase, gebruikt de RNA-subeenheid om de primer-template-junctie te vormen waardoor telomerase het 3-inch uiteinde van chromosoomuiteinden kan verlengen. De geleidelijke afname in grootte van telomeren als resultaat van veel replicaties over een Levensduur wordt verondersteld te worden geassocieerd met de effecten van veroudering.:248–249

Polymerasen γ, θ en ν (gamma, theta en nu) Bewerken

Pol γ (gamma), Pol θ (theta) en Pol ν (nu) zijn familie A-polymerasen. Lang werd gedacht dat Pol γ, gecodeerd door het POLG-gen, het enige mitochondriale polymerase was. toont recent onderzoek aan dat ten minste Pol β (beta), een familie X-polymerase, ook aanwezig is in mitochondriën. Elke mutatie die leidt tot een beperkt of niet-functionerend Pol γ heeft een significant effect op mtDNA en is de meest voorkomende oorzaak van autosomale erfelijke mitochondriale aandoeningen. Pol γ bevat een C-terminus polymerase domein en een N-terminus 3 “-5” exonuclease domein die verbonden via het linkergebied, dat de accessoire-subeenheid bindt. De accessoire subeenheid bindt DNA en is vereist voor processiviteit van Pol γ. Puntmutatie A467T in het linkergebied is verantwoordelijk voor meer dan een derde van alle Pol γ-geassocieerde mitochondriale aandoeningen. Hoewel veel homologen van Pol θ, gecodeerd door het POLQ-gen, in eukaryoten worden aangetroffen, is de functie ervan niet duidelijk begrepen. De volgorde van aminozuren in de C-terminus is wat Pol θ classificeert als familie A-polymerase, hoewel het foutenpercentage voor Pol θ nauwer verwant is aan familie Y-polymerasen. Pol θ verlengt niet-overeenkomende primer-uiteinden en kan abasische plaatsen omzeilen door een nucleotide toe te voegen. Het heeft ook deoxyribofosfodiesterase (dRPase) -activiteit in het polymerasedomein en kan ATPase-activiteit vertonen in de nabijheid van ssDNA. Pol ν (nu) wordt beschouwd als de minst effectieve van de polymerase-enzymen. DNA-polymerase nu speelt echter een actieve rol in homologieherstel tijdens cellulaire reacties op verknopingen, en vervult zijn rol in een complex met helicase.

Planten gebruiken twee Familie A-polymerasen om zowel het mitochondriale als het plastide-genomen te kopiëren. Ze lijken meer op bacterieel Pol I dan op mammaliaans Pol γ.

Reverse transcriptaseEdit

Retrovirussen coderen voor een ongebruikelijke DNA-polymerase genaamd reverse transcriptase, een RNA-afhankelijk DNA-polymerase (RdDp) dat DNA synthetiseert uit een sjabloon van RNA. De reverse transcriptase-familie bevat zowel DNA-polymerasefunctionaliteit als RNase H-functionaliteit, die RNA-basenparen afbreekt aan DNA. Een voorbeeld van een retrovirus is HIV. Reverse transcriptase wordt gewoonlijk gebruikt bij amplificatie van RNA voor onderzoeksdoeleinden. Met behulp van een RNA-sjabloon kan PCR reverse transcriptase gebruiken om een DNA-sjabloon te creëren. Dit nieuwe DNA-sjabloon kan vervolgens worden gebruikt voor typische PCR-amplificatie. De producten van een dergelijk experiment zijn dus geamplificeerde PCR-producten van RNA.

Elk hiv-retrovirusdeeltje bevat twee RNA-genomen, maar na een infectie genereert elk virus slechts één provirus. Na infectie gaat reverse transcriptie gepaard met het omschakelen van de mal tussen de twee genoomkopieën (recombinatie van kopie-keuze). Bij elke replicatiecyclus treden 5 tot 14 recombinatiegebeurtenissen per genoom op. Template-switching (recombinatie) lijkt nodig te zijn voor het behouden van de genoomintegriteit en als een reparatiemechanisme om beschadigde genomen te redden.

Bacteriofaag T4 DNA-polymeraseEdit

Bacteriofaag (faag) T4 codeert voor een DNA-polymerase dat de DNA-synthese in een richting van 5 ‘naar 3’ katalyseert. Het faagpolymerase heeft ook een exonuclease-activiteit die werkt in een richting van 3 ’tot 5’, en deze activiteit wordt gebruikt bij het proeflezen en bewerken van nieuw ingevoegde basen. Er werd waargenomen dat een faagmutant met een temperatuurgevoelige DNA-polymerase, indien gekweekt bij toelaatbare temperaturen, recombinatie onderging bij frequenties die ongeveer tweemaal hoger zijn dan die van wildtype faag.

Er werd voorgesteld dat een mutatieverandering in het faag-DNA-polymerase het wisselen van de templatestreng (recombinatie van de kopie naar keuze) tijdens replicatie kan stimuleren.