Il ceppo murino C57BL / 6 (B6) è il ceppo più utilizzato nella ricerca biomedica, con quasi 25.000 articoli sulla documentazione di Pubmed il suo utilizzo. Quasi la metà di questi articoli cita l’uso di C57BL / 6J (B6 / J), il ceppo B6 originale del Jackson Laboratory (JAX) da cui derivano tutti gli altri substrains B6. Nel 1951, il primo substrain B6, C57BL / 6N (B6 / N), fu creato dopo che gli allevatori furono spediti al National Institutes of Health. Centinaia di generazioni dopo, sono state segnalate numerose differenze genetiche e fenotipiche tra B6 / J e B6 / N. Questo documento discute come sono sorte queste differenze, i problemi di trattare i substrains B6 come uguali e il nostro attuale stato di conoscenza riguardo a queste differenze. Descriverò anche elementi di azione specifici per affrontare l’uso inevitabile di più substrains B6 negli studi di ingegneria genetica e le opportunità che i substrains B6 offrono per trovare nuovi geni che contribuiscono a tratti complessi.
Teoricamente, l’essenza di un inbred è che ogni individuo condivide lo stesso allele omozigote per ogni sequenza di DNA nel genoma e quindi è geneticamente identico. Inoltre, un assunto comune è che questa fissazione sia geneticamente stabile nel tempo. In realtà, una quantità molto piccola del genoma tra due individui qualsiasi sarà sempre diversa, in parte a causa dell’eterozigosità residua unica che ha evitato la fissazione durante la consanguineità e le mutazioni spontanee che introducono eterozigosità de novo. Queste impurità genomiche possono eventualmente fissarsi e portare alla formazione di un nuovo substrain. Questa fissazione si verifica più rapidamente quando un piccolo numero di fondatori viene utilizzato per stabilire una nuova colonia B6 e potrebbe rapidamente contribuire alla deviazione nel proprio fenotipo preferito e, quindi, alla creazione di un nuovo substrain.
Il B6 Il ceppo inbred è una scelta popolare per i ricercatori che conducono studi comportamentali perché è fisicamente attivo, in grado di apprendere una varietà di compiti e si riproduce frequentemente. Inoltre, le differenze fenotipiche tra i substrains B6 (differenze a volte molto grandi) possono offrire flessibilità nello studio di molti comportamenti. Le differenze comportamentali tra B6 / J e B6 / N nel consumo e nella preferenza di etanolo sono state notate all’inizio degli anni ’80 e da allora sono state replicate in almeno due laboratori (rivisto in Bryant et al.1). Altri esempi di differenze fenotipiche ampie e replicabili tra B6 / J e B6 / N includono l’apprendimento della paura e l’ansia che è maggiore in B6 / N rispetto a B6 / J, mentre la sensibilità al dolore e le prestazioni del rotarod sono maggiori in B6 / J rispetto a B6 / N.1,2 Queste differenze consentono ai ricercatori di scegliere il substrain B6 più appropriato per i loro esperimenti. Ad esempio, poiché il ceppo B6 / J beve prontamente etanolo, questo ceppo è appropriato per esaminare le manipolazioni che si ipotizza possano ridurre il consumo di etanolo. Inoltre, poiché il ceppo B6 / N mostra un ampio grado di apprendimento della paura, questo ceppo è la scelta più appropriata per studiare le manipolazioni che dovrebbero diminuire la paura. Il vantaggio di scegliere tra i substrains B6 rispetto ad altri ceppi consanguinei è che i risultati potrebbero essere più applicabili per studi di genetica inversa (ad esempio knockout e transgenici), che utilizzano prevalentemente topi B6. Tuttavia, i ricercatori non sempre riportano il substrain specifico impiegato, rendendo difficile sapere quale è appropriato per un particolare fenotipo.
Il Knockout Mouse Project (KOMP) è uno sforzo internazionale per creare topi che ospitano mutazioni nulle per ciascun gene codificante proteine nel genoma del topo.3 Il ceppo B6 / N è stato impiegato come scelta della linea di cellule staminali embrionali (ES) per ospitare queste mutazioni, probabilmente a causa della sua superiorità tecnica su B6 / J.4 Tuttavia, il il substrain B6 / N specifico utilizzato per KOMP non è del tutto chiaro. Prima dell’avvento di KOMP, la maggior parte degli studi di ingegneria genetica utilizzava cellule ES da un substrain di origine 129 per ospitare la mutazione, principalmente a causa dell’alto tasso di successo della trasmissione della linea germinale dopo l’iniezione di blastocisti. L’uso di B6 / N offre due vantaggi percepiti. In primo luogo, non è più necessario eseguire il backcross di topi mutanti su B6 per creare un topo congenico con un background isogenico: questo è sia costoso che richiede tempo. In secondo luogo, la critica secondo cui i polimorfismi nella regione congenica che fiancheggiava la mutazione potrebbero causare il fenotipo5 non è più valida. Tuttavia, a meno che non venga utilizzato lo stesso identico substrain B6 per introdurre la mutazione e per eseguire il backcross, c’è ancora motivo di preoccupazione che un background misto o la regione congenica possano spiegare i risultati.
set di dati di grandi dimensioni che forniscono SNP tra i substrains B6, ci sono circa 150 SNP con chiamate omozigoti che distinguono B6 / J da B6 / N, a seconda del confronto tra substrain specifico.Al contrario, i substrains N sembrano essere molto più simili tra loro, differendo solo per 10-20 SNP omozigoti su diverse centinaia di migliaia.6 Dati di sequenziamento di nuova generazione pubblicati di recente di C57BL / 6J e C57BL / 6NJ (un substrain N che è ora allevato al JAX) dal Wellcome Trust Center presso il Sanger Institute rivelano molte più potenziali variazioni genetiche.7,8 Anche quando si considerano solo SNP codificanti non sinonimi, ci sono più di 80 chiamate SNP ad alta affidabilità e oltre 400 presunte. Inoltre, ci sono migliaia di altri SNP che potrebbero influenzare i livelli delle varianti di trascrizione e giunzione e le varianti strutturali o del numero di copie. Una query per questo set di dati è fornita dal Wellcome Trust all’indirizzo http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/modelorgs/mousegenomes/snps.pl. È chiaro che le differenze genetiche tra B6 / J e B6 / N sono piuttosto ampie e molto probabilmente contribuiscono alla variazione fenotipica. Pertanto, se una mutazione generata da KOMP (derivata da B6 / N) viene posta su uno sfondo B6 / J, gli stessi problemi che si pensava fossero superati con le cellule ES B6 / N persistono: l’effetto fenotipico della mutazione KOMP potrebbe dipendere sugli sfondi misti B6 / J e B6 / N o l’effetto che si pensa sia causato dalla mutazione KOMP potrebbe effettivamente essere causato da una variante genetica N / J che è in linkage disequilibrium con la mutazione nulla su un background congenico.
Poiché l’elenco delle varianti che distinguono i substrains B6 continua a crescere, quali azioni dovrebbero intraprendere i ricercatori per affrontare i potenziali problemi che possono essere previsti dall’utilizzo di un ceppo di fondo B6 diverso dal ceppo KOMP B6 / N? Innanzitutto, è necessario documentare attentamente quali substrains sono utilizzati per la generazione di cellule ES e il backcrossing e per trattare questi substrains come ceppi diversi, non come ceppi uguali. In secondo luogo, sarebbe estremamente utile per quei ricercatori che sospettano che le loro scoperte precedenti possano essere spiegate dalle differenze di substrain B6 per affrontare questa possibilità e per riportare eventuali conclusioni riviste.9 Inoltre, la scelta del ceppo di fondo B6 per uno studio di ingegneria genetica dovrebbe essere su misura per il fenotipo specifico. Se un ceppo B6 / J deve essere utilizzato come sfondo, il sequenziamento del confine congenico che fiancheggia il transgene e il confronto di questi risultati con i dati di sequenziamento più recenti definirà quanti geni polimorfici all’interno della regione congenica potrebbero potenzialmente influenzare il fenotipo.
Sebbene le differenze genetiche tra i substrains B6 presentino problemi per gli studi genetici inversi, queste stesse differenze offrono opportunità per studi genetici in avanti, che prosperano sulla variazione genetica e fenotipica. L’identificazione di regioni genomiche che ospitano varianti B6 associate alla varianza di un tratto (loci dei tratti quantitativi) potrebbe portare rapidamente all’identificazione dei geni che ospitano le varianti genetiche. Poiché i background genetici tra due qualsiasi substrains B6 sono quasi identici, la maggior parte del genoma può essere eliminata considerando quali geni sono alla base dei QTL. L’utilità di questo approccio per i substrains B6 deve ancora essere testata e dipenderà sia dalla quantità che dalla distribuzione della variazione genetica che è alla base di un QTL. Se gli SNP sono molto abbondanti e ampiamente distribuiti nella maggior parte dei geni, i problemi tipici degli studi F2 continueranno ad esistere: bassa risoluzione e centinaia di geni tra cui analizzare. Se, tuttavia, gli SNP sono limitati a un numero finito di geni, potrebbe essere possibile restringere l’elenco dei geni a un numero considerevole di candidati. Un recente studio che utilizza C57BL / 6J e i ceppi C57L / J e C58 / J strettamente correlati suggerisce che questo approccio sarà utile.10
Per riassumere, i ricercatori devono fare attenzione alle differenze tra i substrains B6 se il loro contributo trasmettere e invertire approcci genetici a tratti complessi deve essere pienamente realizzato. Se i ricercatori sono pronti ad affrontare queste differenze, possono ridurre al minimo i loro potenziali effetti di confusione e, allo stesso tempo, massimizzare le possibilità di scoperta di nuovi geni. Sarà importante sequenziare i genomi di altri substrains di B6 / J e B6 / N perché esistono differenze comportamentali e genetiche anche all’interno di ceppi derivati da ciascuno di questi due substrains principali.1 Infine, è importante considerare che le differenze ambientali possono anche gioca un ruolo importante nella variazione fenotipica tra i substrain B6 e, quindi, questa domanda può essere affrontata da studi di promozione incrociata e altri approcci che tentano di controllare l’ambiente substrain.
