C57BL / 6 (B6) -musstammen är den mest använda stammen i biomedicinsk forskning, med nästan 25 000 artiklar om Pubmed-dokumentation. dess användning. Nästan hälften av dessa artiklar citerar användningen av C57BL / 6J (B6 / J), den ursprungliga B6-stammen från Jackson Laboratory (JAX) från vilken alla andra B6-understram härstammar. 1951 skapades den första B6-understrängen, C57BL / 6N (B6 / N), efter att uppfödare skickades till National Institutes of Health. Hundratals generationer senare har ett antal genetiska och fenotypiska skillnader rapporterats mellan B6 / J och B6 / N. Denna uppsats diskuterar hur dessa skillnader uppstod, problemen med att behandla B6-understrängar som lika och vårt nuvarande kunskapstillstånd om dessa skillnader. Jag kommer också att beskriva specifika åtgärdsposter för att hantera den oundvikliga användningen av flera B6-underströmmar i genteknikstudier och möjligheter som B6-underströmmar erbjuder för att hitta nya gener som bidrar till komplexa egenskaper.
Teoretiskt, essensen av en inavlad stam är att varje individ delar samma homozygota allel för varje DNA-sekvens i genomet och därmed är genetiskt identisk. Dessutom är ett vanligt antagande att denna fixering är genetiskt stabil över tiden. I verkligheten kommer en mycket liten mängd av genomet mellan två individer alltid att skilja sig, delvis på grund av unik kvarvarande heterozygositet som förhindrade fixering under inavel och spontana mutationer som introducerar de novo heterozygositet. Dessa genomiska föroreningar kan så småningom fixas och leda till bildandet av en ny substrain. Denna fixering inträffar snabbare när ett litet antal grundare används för att etablera en ny B6-koloni och snabbt kan bidra till avvikelse i ens favoritfenotyp och därmed till skapandet av en ny understräcka.
B6 inavlad stam är ett populärt val för forskare som genomför beteendestudier eftersom den är fysiskt aktiv, kan lära sig en mängd olika uppgifter och föder ofta. Vidare kan fenotypiska skillnader mellan B6-underströmmar (ibland mycket stora skillnader) erbjuda flexibilitet vid studier av många beteenden. Beteendemässiga skillnader mellan B6 / J och B6 / N i etanolförbrukning och preferens noterades i början av 1980-talet och har sedan dess replikerats i minst två laboratorier (granskat i Bryant et al.1). Andra exempel på stora, replikerbara fenotypiska skillnader mellan B6 / J och B6 / N inkluderar rädslelärande och ångest som är större i B6 / N än i B6 / J, medan smärtkänslighet och rotarodprestanda är större i B6 / J än i B6 / N.1,2 Dessa skillnader gör det möjligt för utredare att välja den mest lämpliga B6-underströmmen för sina experiment. Till exempel, eftersom B6 / J-stammen lätt dricker etanol, är denna stam lämplig för att undersöka manipulationer som antas för att minska etanolförbrukningen. Dessutom, eftersom B6 / N-stammen visar en stor grad av rädslainlärning, är denna stam det mest lämpliga valet för att studera manipulationer som förväntas minska rädslan. Fördelen med att välja bland B6-understrängar i motsats till andra inavlade stammar är att resultaten kan vara mer användbara för omvända genetiska studier (t.ex. knockouts och transgenics), som överväldigande använder B6-möss. Utredarna rapporterar emellertid inte alltid den specifika underström som används, vilket gör det svårt att veta vilken som är lämplig för en viss fenotyp.
Knockout Mouse Project (KOMP) är en internationell insats för att skapa möss som innehåller nullmutationer. för varje proteinkodande gen i musgenomet.3 B6 / N-stammen användes som val av embryonal stamcell (ES) cellinje för att hysa dessa mutationer, troligtvis på grund av dess tekniska överlägsenhet över B6 / J.4. specifikt B6 / N-underbelastning som används för KOMP är inte helt klart. Före tillkomsten av KOMP använde en majoritet av genteknikstudier ES-celler från en understam av 129 ursprung för att hysa mutationen, främst på grund av den höga framgångsgraden för kimlinjeöverföring efter blastocystinjektion. Användningen av B6 / N erbjuder två upplevda fördelar. För det första finns det inte längre något behov av att korsa mutanta möss till B6 för att skapa en kongenisk mus med en isogen bakgrund – detta är både dyrt och tidskrävande. För det andra är kritiken att polymorfier i den kongeniska regionen som flankerade mutationen orsaka fenotypen 5 inte längre giltig. Men om inte exakt samma B6-understräng används för att introducera mutationen och backcross, finns det fortfarande anledning till oro för att en blandad bakgrund eller den kongeniska regionen skulle kunna redogöra för resultaten.
Vid undersökning av en nyligen genomförd stora dataset som tillhandahåller SNP bland B6-underströmmar, det finns cirka 150 SNP med homozygota samtal som skiljer B6 / J från B6 / N, beroende på den specifika jämförelsen av understrängen.Däremot verkar N-substammarna vara mycket mer lik varandra och skiljer sig bara på 10–20 homozygota SNP av flera hundra tusen.6 Nyligen publicerade nästa generations sekvenseringsdata för C57BL / 6J och C57BL / 6NJ (en N-substrain som nu odlas på JAX) från Wellcome Trust Center vid Sanger Institute avslöjar mycket mer potentiell genetisk variation.7,8 Även när man bara överväger icke-synonyma kodande SNP, finns det mer än 80 SNP-samtal med hög förtroende och över 400 förmodade. Dessutom finns det tusentals andra SNP som kan påverka transkriptions- och skarvvarianivåer och struktur- eller kopieringsvarianter. En fråga för denna dataset tillhandahålls av Wellcome Trust på http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/modelorgs/mousegenomes/snps.pl. Det är uppenbart att de genetiska skillnaderna mellan B6 / J och B6 / N är ganska omfattande och sannolikt bidrar till fenotypisk variation. Således, om en KOMP-genererad mutation (B6 / N härledd) placeras på en B6 / J-bakgrund, existerar fortfarande samma problem som tros övervinnas med B6 / N ES-celler: den fenotypiska effekten av KOMP-mutationen kan bero på på de blandade B6 / J- och B6 / N-bakgrunderna eller effekten som tros orsakas av KOMP-mutationen kan faktiskt orsakas av en N / J-genetisk variant som är i kopplingsskillnad med nollmutationen på en kongenisk bakgrund.
Eftersom listan över varianter som skiljer B6-underströmmar fortsätter att växa, vilka åtgärder bör utredare vidta för att hantera de potentiella problem som kan förväntas genom att använda en B6-bakgrundsstam som skiljer sig från KOMP B6 / N-stammen? Först och främst finns det ett behov av att noggrant dokumentera vilka understammar som används för ES-cellgenerering och backcrossing och att behandla dessa understammar som olika stammar, inte som lika. För det andra skulle det vara extremt användbart för de utredare som misstänker att deras tidigare resultat kan förklaras av skillnader i B6-underspänning att ta itu med denna möjlighet och att rapportera eventuella reviderade slutsatser.9 Dessutom bör valet av B6-bakgrundsstam för en genteknikstudie anpassad till den specifika fenotypen. Om en B6 / J-stam måste användas som bakgrund, kommer sekvensering av den kongeniska gränsen som flankerar transgenen och jämförelse av dessa resultat med de senaste sekvenseringsdata definierar hur många polymorfa gener inom den kongeniska regionen som potentiellt kan påverka fenotypen.
Även om genetiska skillnader mellan B6-substammar ger problem för omvänd genetiska studier, erbjuder samma skillnader möjligheter för framåt genetiska studier, som trivs på genetisk och fenotypisk variation. Identifiering av genomregioner som rymmer B6-varianter associerade med varians i ett drag (kvantitativt drag) kan snabbt leda till identifiering av gener som rymmer de genetiska varianterna. Eftersom de genetiska bakgrunderna mellan två B6-substammar är nästan identiska kan majoriteten av genomet elimineras genom att överväga vilka gener som ligger till grund för QTL. Nyttan av detta tillvägagångssätt för B6-underströmmar har ännu inte testats och beror på både mängden och fördelningen av genetisk variation som ligger till grund för en QTL. Om SNP: erna är mycket rikliga och spridda över de flesta generna, så kommer de typiska problemen med F2-studier fortfarande att finnas: låg upplösning och hundratals gener att analysera. Om SNP dock är begränsat till ett begränsat antal gener kan det vara möjligt att begränsa genlistan till ett stort antal kandidater. En nyligen genomförd studie med C57BL / 6J och de närstående C57L / J- och C58 / J-stammarna tyder på att detta tillvägagångssätt kommer att vara användbart.10
Sammanfattningsvis måste forskare vara uppmärksamma på skillnaderna mellan B6-understrängar om deras bidrag att vidarebefordra och vända genetiska tillvägagångssätt för komplexa egenskaper är att förverkligas fullt ut. Om forskare är beredda att ta itu med dessa skillnader kan de minimera deras potentiella förvirrande effekter och samtidigt maximera chansen för ny genupptäckt. Det kommer att vara viktigt att sekvensera genomerna för andra substammar av B6 / J och B6 / N eftersom beteendemässiga och genetiska skillnader existerar även inom stammar härrörande från var och en av dessa två kärnunderstammar.1 Slutligen är det viktigt att överväga att miljöskillnader också kan spela en viktig roll i fenotypisk variation mellan B6-underströmmar och därför kan denna fråga hanteras genom korsfrämjande studier och andra tillvägagångssätt som försöker kontrollera för underströmningsmiljön.
