A cepa de camundongo C57BL / 6 (B6) é a cepa mais amplamente usada em pesquisas biomédicas, com quase 25.000 artigos documentados no Pubmed seu uso. Quase metade desses artigos cita o uso de C57BL / 6J (B6 / J), a cepa B6 original do Jackson Laboratory (JAX) da qual todas as outras sub-cepas B6 foram derivadas. Em 1951, a primeira sub-raína B6, C57BL / 6N (B6 / N), foi criada depois que os criadores foram enviados para o National Institutes of Health. Centenas de gerações depois, uma série de diferenças genéticas e fenotípicas foram relatadas entre B6 / J e B6 / N. Este artigo discute como essas diferenças surgiram, os problemas de tratamento de subcategorias B6 como iguais e nosso estado atual de conhecimento a respeito dessas diferenças. Também delinearei itens de ação específicos para lidar com o uso inevitável de múltiplas sub-cepas B6 em estudos de engenharia genética e oportunidades que as sub-cepas B6 oferecem para encontrar novos genes que contribuem para características complexas.
Teoricamente, a essência de um endogâmico cepa é que cada indivíduo compartilha o mesmo alelo homozigoto para cada sequência de DNA no genoma e, portanto, é geneticamente idêntico. Além disso, uma suposição comum é que essa fixação é geneticamente estável ao longo do tempo. Na realidade, uma parte muito pequena do genoma entre dois indivíduos sempre será diferente, devido em parte à heterozigosidade residual única que evitou a fixação durante a endogamia e mutações espontâneas que introduzem heterozigosidade de novo. Essas impurezas genômicas podem eventualmente se tornar fixas e levar à formação de uma nova subestrutura. Essa fixação ocorre mais rapidamente quando um pequeno número de fundadores é usado para estabelecer uma nova colônia B6 e pode contribuir rapidamente para o desvio no fenótipo favorito de alguém e, portanto, para a criação de um novo substrato.
O B6 A linhagem consanguínea é uma escolha popular para pesquisadores que conduzem estudos comportamentais porque é fisicamente ativa, capaz de aprender uma variedade de tarefas e reproduz com frequência. Além disso, as diferenças fenotípicas entre as sub-raças B6 (às vezes diferenças muito grandes) podem oferecer flexibilidade no estudo de muitos comportamentos. Diferenças comportamentais entre B6 / J e B6 / N no consumo e preferência de etanol foram observadas no início dos anos 1980 e, desde então, foram replicadas em pelo menos dois laboratórios (revisado em Bryant et al.1). Outros exemplos de grandes diferenças fenotípicas replicáveis entre B6 / J e B6 / N incluem aprendizado de medo e ansiedade que é maior em B6 / N do que em B6 / J, enquanto a sensibilidade à dor e o desempenho do rotarod são maiores em B6 / J do que em B6 / N.1,2 Essas diferenças permitem que os investigadores escolham a substrain B6 mais apropriada para seus experimentos. Por exemplo, como a cepa B6 / J bebe etanol rapidamente, essa cepa é apropriada para examinar manipulações que supostamente reduzem o consumo de etanol. Além disso, como a cepa B6 / N mostra um alto grau de aprendizado do medo, essa cepa é a escolha mais apropriada para estudar manipulações que visam diminuir o medo. A vantagem de escolher entre sub-linhagens B6 em oposição a outras linhagens consanguíneas é que os resultados podem ser mais aplicáveis para estudos de genética reversa (por exemplo, nocautes e transgênicos), que usam predominantemente camundongos B6. No entanto, os pesquisadores nem sempre relatam a subestrutura específica empregada, tornando difícil saber qual é apropriada para um determinado fenótipo.
O Knockout Mouse Project (KOMP) é um esforço internacional para criar camundongos com mutações nulas para cada gene codificador de proteína no genoma do camundongo.3 A cepa B6 / N foi empregada como a escolha da linhagem de células-tronco embrionárias (ES) para abrigar essas mutações, provavelmente por causa de sua superioridade técnica sobre B6 / J.4 No entanto, o A substrain B6 / N específica usada para KOMP não é totalmente clara. Antes do advento do KOMP, a maioria dos estudos de engenharia genética usava células ES de uma substraina de origem 129 para abrigar a mutação, principalmente por causa da alta taxa de sucesso da transmissão da linha germinativa após a injeção de blastocisto. O uso de B6 / N oferece duas vantagens percebidas. Primeiro, não há mais necessidade de retrocruzar camundongos mutantes com B6 para criar um camundongo congênico com um fundo isogênico – isso é caro e demorado. Em segundo lugar, a crítica de que polimorfismos na região congênica que flanqueava a mutação poderiam causar o fenótipo5 não é mais válida. No entanto, a menos que a mesma sub-raína B6 seja usada para introduzir a mutação e retrocruzar, ainda há motivo para preocupação de que um fundo misto ou a região congênica possa ser responsável pelos resultados.
Ao examinar um recente grande conjunto de dados fornecendo SNPs entre sub-raças B6, existem aproximadamente 150 SNPs com chamadas homozigóticas que distinguem B6 / J de B6 / N, dependendo da comparação de sub-ramas específicas.Em contraste, as sub-estirpes N parecem ser muito mais semelhantes entre si, diferindo em apenas 10-20 SNPs homozigóticos de várias centenas de milhares.6 Dados de sequenciamento de próxima geração publicados recentemente de C57BL / 6J e C57BL / 6NJ (uma sub-raína N que agora é criado na JAX) do Wellcome Trust Center no Sanger Institute revela muito mais variação genética potencial.7,8 Mesmo quando apenas considerando SNPs de codificação não-sinônima, há mais de 80 chamadas SNP de alta confiança e mais de 400 putativas. Além disso, existem milhares de outros SNPs que podem afetar os níveis de transcrição e variante de emenda e variantes estruturais ou de número de cópias. Uma consulta para este conjunto de dados é fornecida pela Wellcome Trust em http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/modelorgs/mousegenomes/snps.pl. É claro que as diferenças genéticas entre B6 / J e B6 / N são bastante extensas e muito provavelmente contribuem para a variação fenotípica. Assim, se uma mutação gerada por KOMP (derivada de B6 / N) for colocada em um fundo B6 / J, os mesmos problemas que foram pensados para serem superados com células ES B6 / N ainda existem: o efeito fenotípico da mutação KOMP pode depender nos fundos B6 / J e B6 / N mistos ou o efeito que se pensa ser causado pela mutação KOMP pode, na verdade, ser causado por uma variante genética N / J que está em desequilíbrio de ligação com a mutação nula em um fundo congênico.
À medida que a lista de variantes que distinguem as sub-cepas B6 continua a crescer, que ação os investigadores devem tomar para resolver os problemas potenciais que podem ser antecipados com o uso de uma cepa de fundo B6 que é diferente da cepa KOMP B6 / N? Em primeiro lugar, há uma necessidade de documentar cuidadosamente quais sub-cepas são usadas para geração de células ES e retrocruzamento e para tratar essas sub-cepas como cepas diferentes, não como iguais. Em segundo lugar, seria extremamente útil para os investigadores que suspeitam que suas descobertas anteriores podem ser explicadas por diferenças de sub-ramas B6 abordar essa possibilidade e relatar quaisquer conclusões revisadas.9 Além disso, a escolha da cepa de fundo B6 para um estudo de engenharia genética deve ser adaptado ao fenótipo específico. Se uma cepa B6 / J deve ser usada como fundo, o sequenciamento da fronteira congênica que flanqueia o transgene e a comparação desses resultados com os dados de sequenciamento mais recentes definirão quantos genes polimórficos dentro da região congênica podem potencialmente afetar o fenótipo.
Embora as diferenças genéticas entre as sub-estirpes B6 apresentem problemas para estudos de genética reversa, essas mesmas diferenças oferecem oportunidades para estudos genéticos avançados, que prosperam na variação genética e fenotípica. A identificação de regiões genômicas que abrigam variantes B6 associadas à variação em uma característica (loci de características quantitativas) pode levar rapidamente à identificação de genes que abrigam as variantes genéticas. Como as origens genéticas entre quaisquer duas sub-raças B6 são quase idênticas, a maioria do genoma pode ser eliminada ao se considerar quais genes são a base dos QTLs. A utilidade desta abordagem para sub-estirpes B6 ainda não foi testada e dependerá tanto da quantidade quanto da distribuição da variação genética que está por trás de um QTL. Se os SNPs forem altamente abundantes e amplamente distribuídos pela maioria dos genes, os problemas típicos dos estudos F2 ainda existirão: baixa resolução e centenas de genes para analisar. Se, entretanto, os SNPs são limitados a um número finito de genes, então pode ser possível restringir a lista de genes a um número considerável de candidatos. Um estudo recente usando C57BL / 6J e as cepas C57L / J e C58 / J intimamente relacionadas sugere que esta abordagem será útil. 10
Para resumir, os pesquisadores devem estar atentos às diferenças entre as sub-linhagens B6 se sua contribuição avançar e reverter abordagens genéticas para características complexas deve ser totalmente realizado. Se os pesquisadores estiverem preparados para lidar com essas diferenças, eles podem minimizar seus potenciais efeitos de confusão e, ao mesmo tempo, maximizar a chance de descoberta de novos genes. Será importante sequenciar os genomas de outras sub-linhagens de B6 / J e B6 / N porque existem diferenças comportamentais e genéticas mesmo dentro das cepas derivadas de cada uma dessas duas sub-linhagens centrais.1 Finalmente, é importante considerar que as diferenças ambientais também podem desempenham um papel importante na variação fenotípica entre sub-raças B6 e, portanto, essa questão pode ser abordada por estudos de promoção cruzada e outras abordagens que tentam controlar o ambiente de sub-ramas.
