di Joan Bathon, MD (fondatore e direttore del Johns Hopkins Arthritis Center e del sito web del Johns Hopkins Arthritis Center, 1999-2010; Attuale affiliazione, Columbia University)

Nota del direttore del sito web: il dottor Bathon ha condotto uno degli studi fondamentali sull’etanercept dimostrando la sua efficacia nell’artrite reuamtoide chiamato studio ERA. I suoi contributi nel campo dell’AR si estendono dagli studi clinici alla migliore comprensione delle malattie cardiovascolari nell’AR. Sebbene alcune informazioni relative ai TNF disponibili in questo particolare articolo possano essere obsolete, abbiamo mantenuto questo articolo “classico” come parte del nostro archivio per fornire un’importante prospettiva storica di questi agenti che ora sono una parte standard del nostro armamentario di trattamento.

• Introduzione
• TNF e recettori TNF
• Sviluppo di inibitori del TNF
• Studi sugli animali
• Sperimentazioni cliniche sull’uomo
• Potenziali effetti collaterali e precauzioni
• Conclusione

Introduzione

Lo sviluppo di inibitori del fattore di necrosi tumorale (TNF) si è evoluto da un approccio mirato al letto del paziente in cui le lezioni apprese dalla ricerca fisiopatologica di base sono state testate in pazienti con malattie infiammatorie croniche debilitanti, in particolare l’artrite reumatoide (AR). Nella misura in cui tutti i trattamenti precedenti per l’AR si sono evoluti principalmente da osservazioni fortuite, il Gli inibitori del TNF rappresentano il primo trattamento “a base razionale”, così come il f prime proteine ricombinanti approvate dalla FDA (“biologics”) per il trattamento dell’AR.

Mentre un processo antigene-specifico mediato dalle cellule T è indubbiamente critico per l’inizio dell’AR, l’infiammazione prolungata è almeno ugualmente dipendente sulla produzione di citochine da parte di macrofagi sinoviali e fibroblasti che possono agire l’uno sull’altro in modo autocrino o paracrino. Il fattore di necrosi tumorale-a (TNF-a) e l’interleuchina-1 (IL-1) sono le principali citochine derivate dai macrofagi presenti nell’articolazione reumatoide ed entrambi inducono la sintesi e la secrezione da fibroblasti sinoviali di proteasi degradanti la matrice, prostanoidi, interleuchina -6 (IL-6), interleuchina-8 (IL-8) e fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF). Di conseguenza, l’attenzione si è concentrata sull’inibizione del TNF-a come un modo per trattare l’AR.

TNF e recettori del TNF

Fattore di necrosi tumorale-era originariamente chiamato per la sua capacità di innescare la necrosi del trapianto cellule tumorali nei topi. La purificazione e clonazione di una molecola chiamata “cachectina”, che causa deperimento nelle malattie croniche, è stata successivamente trovata identica al TNF-a. Il TNF è prodotto principalmente dai macrofagi e, in misura minore, dai linfociti. 17 membri noti di una famiglia di polipeptidi che si legano a una corrispondente famiglia di recettori. I ligandi polipeptidici sono caratterizzati da una sequenza di nucleo comune che si prevede contenga 10 sequenze di formazione di fogli b e includono TNF-a, linfotossina-ae -b, Fas ligando, ligando CD40 e altri (Tabella I di seguito). Il TNF-a è inizialmente sintetizzato ed espresso come molecola transmembrana, la cui porzione extracellulare viene successivamente scissa dall’enzima TNF-aonvertitore (TACE) per rilasciare la molecola solubile da 17 kDa. TNF solubile -acircola come un omotrimero e impegna i suoi recettori affini sulle superfici cellulari.

Tabella I Membri selezionati della superfamiglia di ligandi / recettori del TNF *.
Ligandi	Recettori
Linfotossina-a TNF-a Linfotossina-b OX40L CD40L FasL CD27L CD30L 4-1BB	TNF-R1 e -RII TNF- RI e -RII LT-bR OX40 CD40 Fas CD27 CD30 4-1BB
*Questa non è una lista completa. Per l’elenco completo dei ligandi e dei recettori del TNF e la nomenclatura aggiornata, vedere il riferimento 4.

In contrasto con la sintesi relativamente limitata dei macrofagi TNF-aby e delle cellule T, i recettori TNF (TNF-R) sono espressi da quasi tutte le cellule di mammifero. Questa espressione onnipresente, in combinazione con le molecole effettrici specifiche della cellula che sono attivate dal TNF-R, può spiegare la varietà degli effetti del TNF che includono l’apoptosi, la sintesi di molecole infiammatorie proteiche e lipidiche e fattori di trascrizione. A differenza di altri ligandi della famiglia TNF-R che si legano a un singolo recettore, TNF e linfotossina-a sono in grado di legarsi a ciascuno dei due TNF-R designati come TNF-RI (o p55) e TNF-RII (o p75) . L’interazione del TNF con il suo recettore innesca un cambiamento conformazionale e la dimerizzazione o il raggruppamento dei recettori che, a sua volta, innesca la risposta cellulare. Il TNF-R, come il loro ligando, può essere separato dalla superficie cellulare mediante TACE, ma si ritiene che il TNF-R solubile sia presente solo in piccole quantità rispetto al TNF-R legato alla membrana.

Sviluppo di inibitori del TNF

Le due strategie per inibire il TNF che sono state più ampiamente studiate fino ad oggi consistono in anticorpi monoclonali anti-TNF e recettori solubili del TNF (sTNF-R) (Tabella II). Entrambi i costrutti si legheranno teoricamente al TNF-a circolante, limitando così la sua capacità di coinvolgere i recettori TNF legati alla membrana cellulare e attivare le vie infiammatorie. Ci si aspetta che anche gli anticorpi TNF-R solubili, ma non anti-TNF, leghino la linfotossina.

Il meglio studiato tra gli anticorpi monoclonali anti-TNF è infliximab (Remicade®), originariamente indicato come cA2. Infliximab è un anticorpo monoclonale chimerico umano / topo anti-TNFa composto da regioni costanti di IgG1κ umana (Hu), accoppiate alla regione Fv di un anticorpo murino anti-HuTNFa neutralizzante ad alta affinità. L’anticorpo mostra un’elevata affinità (Ka 1010 / mol) per huTNFa ricombinante e naturale e neutralizza la citotossicità mediata dal TNF e altre funzioni in vitro. A causa del potenziale di una reazione immunitaria ai componenti proteici murini di un anticorpo chimerico, una strategia alternativa è stata quella di sviluppare un anticorpo monoclonale anti-TNF completamente umano. Uno di questi anticorpi, noto come D2E7, noto anche come adalumimab, è stato generato dalla tecnologia di visualizzazione dei fagi. Un anticorpo monoclonale murino anti-TNF ad alta affinità è stato utilizzato come modello per la selezione guidata, che prevede la sostituzione completa delle catene pesanti e leggere murine con controparti umane e la successiva ottimizzazione dell’affinità di legame con l’antigene. D2E7 (HumiraTM) ha ricevuto l’approvazione della FDA nel dicembre 2002.

Nel secondo approccio all’inibizione del TNF, il TNF-R solubile è stato progettato come proteine di fusione in cui la porzione extracellulare legante il ligando del huTNF- RI o huTNF-RII è accoppiato a una molecola simile all’immunoglobulina umana. Sebbene si ritenga che TNF-RI media la maggior parte degli effetti biologici del TNF in vivo, i costrutti ingegnerizzati di sTNF-RI e sTNF-RII sembrano entrambi efficaci inibitori in vivo del TNF. Etanercept (sTNF-RII: Fc; Enbrel®) è il meglio studiato di sTNF-R ed è approvato per il trattamento dell’artrite reumatoide negli adulti e nei bambini. È un costrutto dimerico in cui due sTNF-RII (p75) sono collegati alla porzione Fc di IgG1 umana. Il recettore dimerico ha un’affinità significativamente più alta per il TNF-a rispetto al recettore monomerico (50-1000 volte più alto) e il collegamento alla struttura Fc prolunga significativamente l’emivita del costrutto in vivo. Sebbene abbia anche un sito di collegamento innaturale, gli anticorpi anti-etanercept sono stati poco frequenti. Un altro meccanismo per prolungare l’emivita dei recettori monomerici è tramite la coniugazione con polietilenglicole. Uno di questi costrutti, PEG-sTNF-RI (p55), ha mostrato efficacia in diversi modelli animali di artrite ed è ora nelle prime sperimentazioni cliniche (vedi sotto).

Studi sugli animali

Esistono diverse linee di prova in modelli animali che supportano l’importanza del TNF-a nella patogenesi dell’AR umana. Sebbene si ritenga che nessun modello animale di artrite infiammatoria imiti completamente l’AR umana, gli studi sugli animali hanno fornito informazioni importanti sui mediatori dell’infiammazione e sul loro potenziale come bersagli terapeutici nella malattia umana. I più convincenti sono i seguenti risultati:

• Livelli elevati di TNF-a nelle articolazioni di topi con artrite indotta da collagene (CIA)
• Miglioramento o prevenzione della CIA con anti -Anticorpi bloccanti il TNF
• Sviluppo spontaneo di artrite infiammatoria in topi transgenici che sovraesprimono TNF-a

Studi su topi con CIA.

Collagene indotto l’artrite (CIA) nel topo è indotta dall’immunizzazione di ceppi di topi sensibili con collagene di tipo II nativo. L’artrite macroscopicamente evidente si manifesta tra il giorno 28-35 dopo l’immunizzazione e persiste per diversi mesi fino all’anchilosio delle articolazioni.La CIA condivide diverse caratteristiche istopatologiche con l’AR, inclusa l’infiltrazione di cellule mononucleate e l’iperplasia delle cellule sinoviali con conseguente formazione di pannus con distruzione di ossa e cartilagine. Sia nell’AR che nella CIA, la suscettibilità alla malattia è limitata dagli alleli MHC di classe II e le cellule T autoreattive sono prominenti nell’articolazione con restrizione nell’uso del recettore delle cellule VbT. A causa di queste somiglianze, la CIA è un modello sperimentale ampiamente utilizzato per l’AR.

Simile all’AR, diversi studi con topi CIA hanno dimostrato livelli elevati di TNF nelle articolazioni artritiche. Recentemente, per valutare il livello di espressione delle citochine durante il corso della CIA, i topi della CIA sono stati sacrificati settimanalmente a partire dal giorno 21, prima dell’inizio dell’artrite clinica. I livelli di mRNA delle citochine nel tessuto articolare sono stati misurati mediante test di protezione dell’RNA altamente quantitativi. I livelli di TNF-a erano elevati all’inizio del decorso della malattia della CIA e persistevano a livelli elevati nelle fasi successive. Livelli elevati di TNF-amRNA sono stati trovati anche in articolazioni non coinvolte macroscopicamente e microscopicamente. Il trattamento settimanale dei topi CIA con un anticorpo monoclonale di criceto neutralizzante contro il TNF-a prima dell’inizio dell’artrite, ha migliorato la gravità della malattia sia istologicamente che clinicamente sebbene l’incidenza dell’artrite non sia cambiata. Il trattamento con anticorpi iniziato subito dopo l’inizio dell’artrite ha avuto un effetto simile, ma meno pronunciato, sulla riduzione della gravità dell’artrite. La terapia anti-TNF era inefficace se somministrata 7 giorni dopo l’insorgenza dell’artrite. Di interesse, l’uso di un anticorpo policlonale contro IL-1a e IL-1b è risultato efficace nella CIA sia nella malattia precoce che in quella tardiva. L’efficacia della terapia anti-TNF solo nelle fasi iniziali della malattia nella CIA murina è in netto contrasto con l’efficacia degli inibitori del TNF negli esseri umani con artrite reumatoide sia precoce che di lunga data (vedere studi clinici di seguito).

Sono stati anche risultati simili ottenuto utilizzando un costrutto di proteina di fusione sTNF-R1-IgG1. La somministrazione di sTNF-R1-IgG1 iniziata prima dell’inizio dell’artrite ha ridotto la gravità dell’artrite ma differiva dagli studi sugli anticorpi monoclonali anche nel diminuire l’incidenza dell’artrite. I topi carenti di TNF-R1 dal targeting genetico erano resistenti allo sviluppo della CIA confermando l’importanza del TNF-R1, forse attraverso la mediazione dell’espressione della molecola di adesione indotta dal TNF e l’infiltrazione di cellule mononucleate nello spazio articolare.

Topi transgenici con sovraespressione TNF-a umano.

I topi transgenici che esprimono un TNF-atransgene umano modificato sviluppano spontaneamente una poliartrite cronica fornendo ulteriori prove del coinvolgimento diretto del TNF nella patogenesi dell’AR umana. I topi portatori di un transgene TNF umano con una regione 3 modificata da un gene globinico umano mostrano un’espressione di TNF umano deregolamentata con conseguente espressione di basso livello di TNF nelle articolazioni e in una varietà di altri organi. Al contrario, i topi che trasportano un transgene TNF umano di tipo selvatico hanno mostrato un’espressione di TNF adeguatamente regolata. I topi con espressione di TNF deregolamentata hanno sviluppato una poliartrite simmetrica cronica con caratteristiche istologiche simili all’AR umano. Questo processo non richiedeva un background genetico specifico nei topi bersaglio.

Nonostante le differenze con l’AR umana, questi modelli animali supportano fortemente il TNF come obiettivo importante per l’intervento terapeutico.

Umano Studi clinici

Poiché la sicurezza degli inibitori del TNF nell’uomo era sconosciuta, i primi studi sull’AR erano rivolti a pazienti con malattia grave e di vecchia data che non avevano risposto adeguatamente ai trattamenti convenzionali come metotrexato, sali d’oro, immunosoppressori e altri. Più di recente, con lo sviluppo della sicurezza di questi agenti, sono stati presi di mira i pazienti con AR giovanile e gli adulti con AR precoce. Un’evoluzione nella selezione dei risultati degli studi si è verificata anche in quanto gli studi precedenti si sono concentrati sui parametri clinici come endpoint, mentre gli studi più recenti si sono concentrati sugli endpoint strutturali (radiografici).

Alcuni dei dati clinici che hanno portato a sarà presentata l’approvazione della FDA di due terapie anti-TNF per il trattamento dell’AR. Gli agenti da discutere sono:

• infliximab – anticorpo chimerico murino-umano anti-TNF umano
• etanercept – recettore solubile del TNF p75 accoppiato alla porzione Fc di IgG

Gli esiti rilevanti valutati negli studi clinici di potenziali terapie per l’AR includono parametri clinici individuali, punteggi compositi che integrano più parametri clinici e punteggi radiografici.

Esempi di parametri clinici individuali include:

• conta delle articolazioni dolenti
• conta delle articolazioni gonfie
• velocità di sedimentazione degli eritrociti (ESR) o proteina C-reattiva (CRP)
• scale analogiche visive per dolore, funzione, valutazione globale

Un esempio di punteggio composito è il punteggio ACR20.

Tuttavia, il “gold standard” per valutare l’efficacia di un trattamento nell’artrite reumatoide è la sua capacità di rallentare o arrestare la progressione radiografica della malattia, ovvero il trattamento deve rallentare o arrestare lo sviluppo di nuove o allargando le erosioni e rallentando lo sviluppo di un restringimento dello spazio articolare nuovo o progressivo. Sono stati sviluppati diversi sistemi di punteggio per quantificare queste manifestazioni radiologiche di RA.

Sia infliximab che etanercept sono stati ampiamente studiati in soggetti umani, ed entrambi sono ora approvati dalla FDA per il trattamento dell’AR. Inizialmente, a causa della natura sperimentale di questi trattamenti, sono stati valutati solo i pazienti con RA grave di lunga data e il risultato identificato era un miglioramento clinico (ma non radiologico). Sebbene molti di questi pazienti avevano fallito diversi trattamenti convenzionali per l’AR (come metotrexato, oro, ecc.), le risposte cliniche agli inibitori del TNF sono state gratificantemente robuste e rapide. Più recentemente, i pazienti con e arly malattia sono stati presi di mira per lo studio e le loro risposte sono state altrettanto robuste. Ancora più convincenti sono i dati radiografici nei pazienti con malattia sia precoce che tardiva che dimostrano la capacità degli agenti anti-TNF di rallentare o arrestare il danno radiografico nella maggior parte dei pazienti.

Questi dati forniscono la “prova del concetto” in esseri umani che il TNF è davvero un importante mediatore patogeno del danno articolare nell’AR. Forse la cosa più intrigante di questi studi è che il targeting (inibendo) una singola citochina può alterare profondamente la storia naturale di questa malattia.

Potenziali effetti collaterali e precauzioni

Il TNF svolge un ruolo importante nelle difese dell’ospite, in particolare nell’uccisione di microrganismi intracellulari come Listeria e micobatteri, e nell’indurre l’apoptosi di alcune cellule tumorali. Di conseguenza, c’è stata qualche preoccupazione che a lungo l’inibizione a termine del TNF potrebbe portare ad una maggiore incidenza di infezioni e di tumori maligni. Inoltre, poiché questi agenti sono proteine geneticamente modificate che verranno somministrate ripetutamente per lunghi periodi per il trattamento di c malattie croniche, problemi di immunogenicità e reazioni di iniezione richiedono un esame accurato.

• reazioni al sito di iniezione
• infezioni
• neoplasie
• immunogenicità

Reazioni nel sito di iniezione

Sia con etanercept che con infliximab, le reazioni di iniezione rappresentano l’effetto collaterale più frequente e consistente, sebbene raramente limitino la somministrazione dei farmaci. Le reazioni si verificano subito dopo l’inizio del trattamento, sono generalmente lievi e autolimitanti, si riducono e poi si risolvono completamente con dosi ripetute.

Infezioni

Diversi studi su esseri umani e animali dimostrano l’importanza del TNF -come difesa contro l’infezione da organismi intracellulari come Listeria e Mycobactaeria, sollevando preoccupazioni circa il potenziale aumento delle infezioni con inibizione cronica del TNF. Il TNF è aumentato nella circolazione sistemica dopo la somministrazione di endotossine o batteri e il TNF insieme a IL-1 sono responsabili delle alterazioni fisiologiche osservate nello shock settico. I topi con deficit di TNF-a > da parte del gene targeting mancano di follicoli primari delle cellule B e mostrano una risposta immunitaria umorale ridotta agli antigeni T-dipendenti e T indipendenti. I topi carenti di TNF-a, TNFR1 (p55) o TNFR2 (p75) sono altamente suscettibili all’infezione da Listeria monocytogenes. In uno studio clinico sull’uomo, il trattamento dello shock settico con etanercept ha determinato un aumento della mortalità nei pazienti con organismi gram-positivi.

Nonostante queste preoccupazioni, studi clinici controllati con etanercept da solo o in combinazione con metotrexato non hanno mostrato un aumento in qualsiasi frequenza, tipo o gravità delle infezioni. In uno studio con infliximab, tuttavia, i ricercatori hanno riportato un decesso ciascuno dovuto a tubercolosi e coccidiomicosi. Dal momento che infliximab ed etanercept sono stati approvati dalla FDA e disponibili in commercio, è stato segnalato un numero di casi di tubercolosi e infezioni fungine superiore al previsto. Questi sembrano essere più frequenti con infliximab, forse a causa delle differenze nella stechiometria e del più lento “off-rate” di infliximab rispetto a etanercept. Uno screening accurato dei pazienti per la TB latente e attiva prima dell’inizio della terapia anti-TNF è ora raccomandato È inoltre indicato un attento monitoraggio dell’infezione nei pazienti trattati con inibitori del TNF.

Malignità

Il sistema immunitario ha un ruolo importante nella sorveglianza della malignità, e il ruolo del TNF, in particolare , nell’innescare l’apoptosi di alcuni tipi di cellule tumorali è già stato notato. Pertanto, un aumento del rischio di malignità è di preoccupazione teorica con l’inibizione cronica del TNF a lungo termine. Sfortunatamente, gli studi clinici a breve termine non possono affrontare adeguatamente questa domanda. A 3 anni follow-up di pazienti trattati con inibitori del TNF negli studi clinici, tuttavia, non è ancora emerso alcun aumento apparente del tasso o del tipo di tumori maligni.Tuttavia, risposte definitive al rischio di malignità attendono i dati di trattamento a lungo termine in una popolazione più ampia. Sono stati istituiti registri per raccogliere questi dati.

Immunogenecity

Infliximab è un anticorpo monoclonale chimerico contenente il 25% di sequenza murina nel sito di legame per il TNF. È preoccupante il potenziale della sequenza murina di suscitare una risposta anticorpale anti-infliximab o anti-chimerica umana che limiterebbe l’efficacia terapeutica. Tali anticorpi sono stati effettivamente trovati ma possono essere soppressi mediante l’uso concomitante di metotrexato. L’effetto di questi anticorpi sull’efficacia terapeutica rimane poco chiaro.

Sebbene etanercept sia composto interamente da sequenza umana, i neoepitopi potrebbero essere generati nelle regioni di unione del recettore TNF e della regione Fc dell’immunoglobulina che potrebbero provocare un risposta anticorpale etanercept. Questo non sembra essere rilevante. Nei due studi pubblicati, gli anticorpi anti-etanercept non bloccanti sono stati trovati solo in 2 pazienti e non hanno avuto un effetto notevole sull’efficacia.

Di eziologia e significato clinico poco chiari è lo sviluppo di bassi titoli di anti -anticorpi DNA a doppia elica (anti-ds-DNA) in pazienti trattati con infliximab ed etanercept. Gli anticorpi anti-ds-DNA sono considerati specifici per il lupus eritematoso sistemico. Tuttavia, in generale, i pazienti trattati con infliximab o etanercept che hanno sviluppato questi anticorpi non presentano malattie simili al lupus.

Conclusione

Studi in vitro hanno suggerito che il TNF è un mediatore critico e prossimale di la via infiammatoria nell’articolazione reumatoide. La prova del concetto per questa ipotesi è stata ora fornita da studi su animali e sperimentazioni cliniche. Non solo l’inibizione del TNF riduce drasticamente i marker dell’infiammazione, ma rallenta o arresta anche il danno strutturale, e questi effetti sembrano essere potenti sia nelle fasi iniziali della malattia che in quelle tardive. In termini umani, queste efficacia dovrebbero tradursi in una minore disabilità funzionale e una migliore qualità della vita.

Le solide risposte al trattamento con inibitori del TNF nell’artrite reumatoide e nelle malattie infiammatorie intestinali sono probabilmente la punta dell’iceberg. Qualsiasi malattia infiammatoria cronica (non infettiva) che è principalmente guidata dai macrofagi potrebbe essere un potenziale bersaglio per la terapia anti-TNF. Ad esempio, sono attualmente in corso studi pilota per valutare l’efficacia degli inibitori del TNF nella granulomatosi di Wegeners, nell’artrite psoriasica, nell’insufficienza cardiaca congestizia e in altre malattie.

Il potenziale contributo dell’interleuchina-1, indipendente dal TNF-a, negli stati infiammatori cronici resta da chiarire ma è probabile che un approccio combinato per inibire entrambe le monochine sarà ancora più potente di entrambi gli approcci solitari. Infine, il rimbalzo dell’attività della malattia che si verifica dopo la cessazione della terapia anti-TNF è un promemoria che fa riflettere che la cascata infiammatoria è stata interrotta neutralizzando il TNF, ma che la causa o le cause alla base della malattia stessa non sono state affrontate. / p>

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