Der Mausstamm C57BL / 6 (B6) ist mit fast 25.000 Artikeln in Pubmed der am häufigsten verwendete Stamm in der biomedizinischen Forschung sein Nutzen. Fast die Hälfte dieser Artikel zitiert die Verwendung von C57BL / 6J (B6 / J), dem ursprünglichen B6-Stamm aus dem Jackson Laboratory (JAX), von dem alle anderen B6-Substämme abgeleitet wurden. 1951 wurde der erste B6-Substrain, C57BL / 6N (B6 / N), geschaffen, nachdem die Züchter an die National Institutes of Health verschifft worden waren. Hunderte von Generationen später wurde über eine Reihe genetischer und phänotypischer Unterschiede zwischen B6 / J und B6 / N berichtet. In diesem Artikel werden die Entstehung dieser Unterschiede, die Probleme bei der Behandlung von B6-Substrains als gleichwertig und unser derzeitiger Kenntnisstand in Bezug auf diese Unterschiede erörtert. Ich werde auch spezifische Aktionselemente für den Umgang mit der unvermeidbaren Verwendung mehrerer B6-Substrains in gentechnischen Studien und Möglichkeiten skizzieren, die B6-Substrains bieten, um neuartige Gene zu finden, die zu komplexen Merkmalen beitragen.
Theoretisch die Essenz einer Inzucht Stamm ist, dass jedes Individuum für jede DNA-Sequenz im Genom das gleiche homozygote Allel teilt und somit genetisch identisch ist. Darüber hinaus wird häufig davon ausgegangen, dass diese Fixierung über die Zeit genetisch stabil ist. In der Realität wird sich eine sehr kleine Menge des Genoms zwischen zwei Individuen immer unterscheiden, was teilweise auf die einzigartige verbleibende Heterozygotie zurückzuführen ist, die die Fixierung während der Inzucht verhinderte, und auf spontane Mutationen, die eine De-novo-Heterozygotie einführen. Diese genomischen Verunreinigungen können schließlich fixiert werden und zur Bildung eines neuen Substrains führen. Diese Fixierung erfolgt schneller, wenn eine kleine Anzahl von Gründern zur Gründung einer neuen B6-Kolonie verwendet wird, und könnte schnell zur Abweichung des bevorzugten Phänotyps und damit zur Schaffung eines neuen Substrains beitragen.
Die B6 Inzuchtstamm ist eine beliebte Wahl für Forscher, die Verhaltensstudien durchführen, da er körperlich aktiv ist, eine Vielzahl von Aufgaben erlernen kann und häufig brütet. Darüber hinaus können phänotypische Unterschiede zwischen B6-Substrains (manchmal sehr große Unterschiede) Flexibilität bei der Untersuchung vieler Verhaltensweisen bieten. Verhaltensunterschiede zwischen B6 / J und B6 / N in Bezug auf Ethanolverbrauch und -präferenz wurden in den frühen 1980er Jahren festgestellt und wurden seitdem in mindestens zwei Laboratorien wiederholt (Übersicht in Bryant et al.1). Andere Beispiele für große, reproduzierbare phänotypische Unterschiede zwischen B6 / J und B6 / N sind Angstlernen und Angst, die bei B6 / N größer sind als bei B6 / J, während die Schmerzempfindlichkeit und die Rotarodleistung bei B6 / J größer sind als bei B6 / J. N.1,2 Diese Unterschiede ermöglichen es den Forschern, den am besten geeigneten B6-Substrain für ihre Experimente auszuwählen. Da der B6 / J-Stamm beispielsweise leicht Ethanol trinkt, eignet sich dieser Stamm zur Untersuchung von Manipulationen, von denen angenommen wird, dass sie den Ethanolverbrauch senken. Da der B6 / N-Stamm ein hohes Maß an Angstlernen aufweist, ist dieser Stamm außerdem die am besten geeignete Wahl für die Untersuchung von Manipulationen, von denen erwartet wird, dass sie die Angst verringern. Der Vorteil der Auswahl zwischen B6-Substämmen im Gegensatz zu anderen Inzuchtstämmen besteht darin, dass die Ergebnisse möglicherweise besser für reverse genetische Studien (z. B. Knockouts und Transgene) geeignet sind, bei denen überwiegend B6-Mäuse verwendet werden. Die Forscher berichten jedoch nicht immer über den verwendeten spezifischen Substrain, was es schwierig macht zu wissen, welcher für einen bestimmten Phänotyp geeignet ist.
Das Knockout Mouse Project (KOMP) ist eine internationale Initiative zur Schaffung von Mäusen mit Nullmutationen für jedes Protein-kodierende Gen im Mausgenom.3 Der B6 / N-Stamm wurde als Wahl der embryonalen Stammzelllinie (ES) zur Aufnahme dieser Mutationen verwendet, wahrscheinlich aufgrund seiner technischen Überlegenheit gegenüber B6 / J.4 Der für BOMP verwendete spezifische B6 / N-Substrain ist nicht ganz klar. Vor dem Aufkommen von KOMP verwendeten die meisten gentechnischen Studien ES-Zellen aus einem Substamm 129-Ursprungs, um die Mutation zu beherbergen, hauptsächlich wegen der hohen Erfolgsrate der Keimbahnübertragung nach Blastozysteninjektion. Die Verwendung von B6 / N bietet zwei wahrgenommene Vorteile. Erstens besteht keine Notwendigkeit mehr, mutierte Mäuse auf B6 zurückzukreuzen, um eine kongene Maus mit einem isogenen Hintergrund zu erzeugen – dies ist sowohl teuer als auch zeitaufwendig. Zweitens ist die Kritik, dass Polymorphismen in der kongenen Region, die die Mutation flankierte, den Phänotyp5 verursachen könnten, nicht mehr gültig. Wenn jedoch nicht genau derselbe B6-Substrain zur Einführung der Mutation und zur Rückkreuzung verwendet wird, besteht weiterhin Grund zur Sorge, dass ein gemischter Hintergrund oder die kongene Region für die Ergebnisse verantwortlich sein könnten.
Bei der Untersuchung eines kürzlich durchgeführten Bei einem großen Datensatz, der SNPs unter B6-Substrains bereitstellt, gibt es ungefähr 150 SNPs mit homozygoten Aufrufen, die B6 / J von B6 / N unterscheiden, abhängig vom spezifischen Substrain-Vergleich.Im Gegensatz dazu scheinen sich die N-Substrains viel ähnlicher zu sein und unterscheiden sich bei nur 10–20 homozygoten SNPs von mehreren hunderttausend.6 Kürzlich veröffentlichte Sequenzierungsdaten der nächsten Generation von C57BL / 6J und C57BL / 6NJ (ein N-Substrain) das jetzt bei JAX gezüchtet wird) vom Wellcome Trust Center am Sanger Institute zeigen viel mehr potenzielle genetische Variationen.7,8 Selbst wenn man nicht-synonym codierende SNPs berücksichtigt, gibt es mehr als 80 hoch vertrauenswürdige SNP-Anrufe und über 400 mutmaßliche. Darüber hinaus gibt es Tausende anderer SNPs, die die Transkript- und Spleißvariantenebenen sowie die Struktur- oder Kopienzahlvarianten beeinflussen können. Eine Abfrage für diesen Datensatz wird vom Wellcome Trust unter http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/modelorgs/mousegenomes/snps.pl bereitgestellt. Es ist klar, dass die genetischen Unterschiede zwischen B6 / J und B6 / N ziemlich groß sind und höchstwahrscheinlich zur phänotypischen Variation beitragen. Wenn also eine KOMP-generierte Mutation (B6 / N abgeleitet) auf einen B6 / J-Hintergrund gestellt wird, bestehen immer noch dieselben Probleme, von denen angenommen wurde, dass sie mit B6 / N ES-Zellen überwunden werden: Der phänotypische Effekt der KOMP-Mutation könnte davon abhängen auf den gemischten B6 / J- und B6 / N-Hintergründen oder der Effekt, von dem angenommen wird, dass er durch die KOMP-Mutation verursacht wird, könnte tatsächlich durch eine genetische N / J-Variante verursacht werden, die sich im Bindungsungleichgewicht mit der Nullmutation auf einem kongenen Hintergrund befindet.
Welche Maßnahmen sollten Forscher ergreifen, um die potenziellen Probleme zu lösen, die bei der Verwendung eines B6-Hintergrundstamms, der sich vom KOMP B6 / N-Stamm unterscheidet, zu erwarten sind, da die Liste der Varianten, die B6-Substämme unterscheiden, weiter wächst? In erster Linie muss sorgfältig dokumentiert werden, welche Substrains für die Erzeugung und Rückkreuzung von ES-Zellen verwendet werden, und diese Substrains als unterschiedliche Stämme und nicht als gleiche Stämme behandelt werden. Zweitens wäre es äußerst hilfreich für diejenigen Forscher, die den Verdacht haben, dass ihre früheren Ergebnisse durch Unterschiede im B6-Substrain erklärt werden könnten, diese Möglichkeit anzusprechen und überarbeitete Schlussfolgerungen zu melden.9 Darüber hinaus sollte die Wahl des B6-Hintergrundstamms für eine gentechnische Studie getroffen werden auf den spezifischen Phänotyp zugeschnitten. Wenn ein B6 / J-Stamm als Hintergrund verwendet werden muss, wird durch Sequenzieren der das Transgen flankierenden kongenen Grenze und Vergleichen dieser Ergebnisse mit den neuesten Sequenzierungsdaten definiert, wie viele polymorphe Gene innerhalb der kongenen Region möglicherweise den Phänotyp beeinflussen könnten.
Obwohl genetische Unterschiede zwischen B6-Substrains Probleme für umgekehrte genetische Studien darstellen, bieten diese Unterschiede Möglichkeiten für vorwärtsgenetische Studien, die von genetischen und phänotypischen Variationen leben. Die Identifizierung von Genomregionen mit B6-Varianten, die mit der Varianz in einem Merkmal assoziiert sind (quantitative Merkmalsorte), könnte schnell zur Identifizierung von Genen führen, die die genetischen Varianten enthalten. Da die genetischen Hintergründe zwischen zwei beliebigen B6-Substämmen nahezu identisch sind, kann der Großteil des Genoms eliminiert werden, wenn berücksichtigt wird, welche Gene den QTLs zugrunde liegen. Die Nützlichkeit dieses Ansatzes für B6-Substrains muss noch getestet werden und hängt sowohl von der Menge als auch von der Verteilung der genetischen Variation ab, die einer QTL zugrunde liegt. Wenn die SNPs sehr häufig und über die meisten Gene verteilt sind, bestehen immer noch die typischen Probleme von F2-Studien: niedrige Auflösung und Hunderte von Genen, unter denen analysiert werden kann. Wenn die SNPs jedoch auf eine begrenzte Anzahl von Genen beschränkt sind, kann die Genliste möglicherweise auf eine beträchtliche Anzahl von Kandidaten eingegrenzt werden. Eine kürzlich durchgeführte Studie unter Verwendung von C57BL / 6J und den eng verwandten C57L / J- und C58 / J-Stämmen legt nahe, dass dieser Ansatz nützlich sein wird.10
Zusammenfassend müssen Forscher die Unterschiede zwischen B6-Substrains berücksichtigen, wenn sie dazu beitragen genetische Ansätze für komplexe Merkmale voranzutreiben und umzukehren, ist vollständig zu verwirklichen. Wenn Forscher bereit sind, diese Unterschiede anzugehen, können sie ihre potenziellen störenden Auswirkungen minimieren und gleichzeitig die Chance für die Entdeckung neuer Gene maximieren. Es wird wichtig sein, die Genome anderer Substämme von B6 / J und B6 / N zu sequenzieren, da Verhaltens- und genetische Unterschiede auch innerhalb von Stämmen bestehen, die von jedem dieser beiden Kernsubstämme abgeleitet sind.1 Schließlich ist es wichtig zu berücksichtigen, dass auch Umweltunterschiede auftreten können spielen eine wichtige Rolle bei der phänotypischen Variation zwischen B6-Substrains, und daher kann diese Frage durch Cross-Foster-Studien und andere Ansätze beantwortet werden, die versuchen, die Substrain-Umgebung zu kontrollieren.
