De C57BL / 6 (B6) -muisstam is de meest gebruikte soort in biomedisch onderzoek, met bijna 25.000 artikelen over Pubmed-documentatie het gebruik ervan. Bijna de helft van deze artikelen noemt het gebruik van C57BL / 6J (B6 / J), de oorspronkelijke B6-stam van het Jackson Laboratory (JAX) waarvan alle andere B6-substrains zijn afgeleid. In 1951 werd de eerste B6-substraam, C57BL / 6N (B6 / N), gemaakt nadat fokkers naar de National Institutes of Health waren verzonden. Honderden generaties later zijn er een aantal genetische en fenotypische verschillen gerapporteerd tussen B6 / J en B6 / N. Dit artikel bespreekt hoe deze verschillen zijn ontstaan, de problemen bij het behandelen van B6-substrains als gelijken, en onze huidige kennis over deze verschillen. Ik zal ook specifieke actiepunten schetsen voor het omgaan met het onvermijdelijke gebruik van meerdere B6-substrains in genetische manipulatiestudies en kansen die B6-substrains bieden voor het vinden van nieuwe genen die bijdragen aan complexe eigenschappen.
Theoretisch gezien de essentie van een inteelt stam is dat elk individu hetzelfde homozygote allel deelt voor elke DNA-sequentie in het genoom en dus genetisch identiek is. Bovendien wordt algemeen aangenomen dat deze fixatie genetisch stabiel is in de tijd. In werkelijkheid zal een zeer klein deel van het genoom tussen twee individuen altijd verschillen, deels als gevolg van de unieke resterende heterozygotie die fixatie tijdens inteelt afweerde en spontane mutaties die de novo heterozygotie introduceren. Deze genomische onzuiverheden kunnen uiteindelijk worden gefixeerd en leiden tot de vorming van een nieuwe substroom. Deze fixatie vindt sneller plaats wanneer een klein aantal oprichters wordt gebruikt om een nieuwe B6-kolonie te vestigen en zou snel kunnen bijdragen aan de afwijking in iemands favoriete fenotype en dus aan de creatie van een nieuwe substroom.
De B6 inteeltstam is een populaire keuze voor onderzoekers die gedragsstudies uitvoeren, omdat het fysiek actief is, in staat is om een verscheidenheid aan taken te leren en vaak fokt. Bovendien kunnen fenotypische verschillen tussen B6-substrains (soms zeer grote verschillen) flexibiliteit bieden bij het bestuderen van veel gedragingen. Gedragsverschillen tussen B6 / J en B6 / N in ethanolgebruik en -voorkeur werden opgemerkt in het begin van de jaren tachtig en zijn sindsdien gerepliceerd in ten minste twee laboratoria (besproken in Bryant et al.1). Andere voorbeelden van grote, repliceerbare fenotypische verschillen tussen B6 / J en B6 / N zijn onder meer het leren van angst en angst die groter is in B6 / N dan in B6 / J, terwijl pijngevoeligheid en rotarodprestaties groter zijn in B6 / J dan in B6 / N.1,2 Door deze verschillen kunnen onderzoekers de meest geschikte B6-substraining kiezen voor hun experimenten. Omdat de B6 / J-stam bijvoorbeeld gemakkelijk ethanol drinkt, is deze stam geschikt voor het onderzoeken van manipulaties waarvan wordt verondersteld dat ze het ethanolverbruik verminderen. Omdat de B6 / N-stam bovendien een grote mate van leren van angst vertoont, is deze stam de meest geschikte keuze voor het bestuderen van manipulaties die naar verwachting de angst zullen verminderen. Het voordeel van het kiezen tussen B6-substrains in tegenstelling tot andere inteeltstammen, is dat de resultaten mogelijk beter toepasbaar zijn voor reverse genetische studies (bijv. Knockouts en transgenics), die overwegend B6-muizen gebruiken. Onderzoekers rapporteren echter niet altijd de specifieke substrain die wordt gebruikt, waardoor het moeilijk is om te weten welke geschikt is voor een bepaald fenotype.
Het Knockout Mouse Project (KOMP) is een internationale poging om muizen te creëren met nulmutaties. voor elk eiwitcoderend gen in het muisgenoom.3 De B6 / N-stam werd gebruikt als de keuze van de embryonale stam (ES) cellijn voor het herbergen van deze mutaties, waarschijnlijk vanwege zijn technische superioriteit ten opzichte van B6 / J.4 specifieke B6 / N-substrain die wordt gebruikt voor KOMP is niet helemaal duidelijk. Vóór de komst van KOMP werd in een meerderheid van de genetische manipulatiestudies ES-cellen van een deelstam van 129 oorsprong gebruikt om de mutatie te herbergen, voornamelijk vanwege het hoge succespercentage van kiembaantransmissie na blastocystinjectie. Het gebruik van B6 / N biedt twee waargenomen voordelen. Ten eerste is het niet langer nodig om mutante muizen terug te kruisen naar B6 om een congene muis met een isogene achtergrond te creëren – dit is zowel duur als tijdrovend. Ten tweede is de kritiek dat polymorfismen in het aangeboren gebied dat de mutatie flankeerde, het fenotype5 zouden kunnen veroorzaken, niet langer geldig. Tenzij echter exact dezelfde B6-substroom wordt gebruikt om de mutatie te introduceren, en om terug te kruisen, is er nog steeds reden tot bezorgdheid dat een gemengde achtergrond of de congene regio de resultaten zou kunnen verklaren.
Bij het onderzoeken van een recente grote dataset die SNP’s levert tussen B6-substrains, zijn er ongeveer 150 SNP’s met homozygote aanroepen die B6 / J onderscheiden van B6 / N, afhankelijk van de specifieke substrain-vergelijking.Daarentegen lijken de N-substrains veel meer op elkaar te lijken, ze verschillen slechts 10-20 homozygote SNP’s van enkele honderdduizenden.6 Recent gepubliceerde sequentiegegevens van de volgende generatie van C57BL / 6J en C57BL / 6NJ (een N-substrain dat nu gefokt is bij JAX) van het Wellcome Trust Center van het Sanger Institute onthullen veel meer potentiële genetische variatie.7,8 Zelfs als we alleen kijken naar niet-synonieme coderende SNP’s, zijn er meer dan 80 zeer betrouwbare SNP-oproepen en meer dan 400 vermoedelijke. Bovendien zijn er duizenden andere SNP’s die van invloed kunnen zijn op transcript- en splitsingsvariantniveaus en structurele of kopie-nummervarianten. Een zoekopdracht voor deze dataset wordt geleverd door de Wellcome Trust op http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/modelorgs/mousegenomes/snps.pl. Het is duidelijk dat de genetische verschillen tussen B6 / J en B6 / N vrij uitgebreid zijn en hoogstwaarschijnlijk bijdragen aan fenotypische variatie. Dus als een door KOMP gegenereerde mutatie (afgeleid van B6 / N) op een B6 / J-achtergrond wordt geplaatst, bestaan dezelfde problemen waarvan werd aangenomen dat ze opgelost waren met B6 / N ES-cellen: het fenotypische effect van de KOMP-mutatie kan afhangen van op de gemengde B6 / J- en B6 / N-achtergronden of het effect waarvan wordt gedacht dat het wordt veroorzaakt door de KOMP-mutatie, kan feitelijk worden veroorzaakt door een N / J-genetische variant die in onevenwichtigheid verkeert met de nulmutatie op een aangeboren achtergrond.
Terwijl de lijst van varianten die B6-substrains onderscheiden blijft groeien, welke actie moeten onderzoekers ondernemen om de mogelijke problemen aan te pakken die kunnen worden verwacht bij het gebruik van een B6-achtergrondstam die verschilt van de KOMP B6 / N-stam? Eerst en vooral is het nodig om zorgvuldig te documenteren welke substrains worden gebruikt voor het genereren en terugkruisen van ES-cellen en om deze substrains als verschillende stammen te behandelen, niet als gelijke. Ten tweede zou het buitengewoon nuttig zijn voor die onderzoekers die vermoeden dat hun eerdere bevindingen kunnen worden verklaard door verschillen in de B6-substrains om deze mogelijkheid aan te pakken en eventuele herziene conclusies te rapporteren.9 Bovendien zou de keuze van de B6-achtergrondstam voor een genetische manipulatie afgestemd op het specifieke fenotype. Als een B6 / J-stam als achtergrond moet worden gebruikt, zal het sequencen van de congene grens die het transgen flankeert en het vergelijken van deze resultaten met de nieuwste sequentiegegevens bepalen hoeveel polymorfe genen binnen het congene gebied mogelijk het fenotype kunnen beïnvloeden.
Hoewel genetische verschillen tussen B6-substrains problemen opleveren voor omgekeerde genetische studies, bieden dezelfde verschillen kansen voor voorwaartse genetische studies, die gedijen op genetische en fenotypische variatie. De identificatie van genomische regio’s die B6-varianten herbergen die geassocieerd zijn met variantie in een eigenschap (kwantitatieve eigenschaploci), zou snel kunnen leiden tot de identificatie van genen die de genetische varianten herbergen. Omdat de genetische achtergronden tussen twee B6-substrains bijna identiek zijn, kan het grootste deel van het genoom worden geëlimineerd door te overwegen welke genen ten grondslag liggen aan de QTL’s. Het nut van deze benadering voor B6-substrains moet nog worden getest en zal afhangen van zowel de hoeveelheid als de distributie van genetische variatie die ten grondslag ligt aan een QTL. Als de SNP’s zeer overvloedig zijn en wijd verspreid over de meeste genen, dan zullen de typische problemen van F2-onderzoeken nog steeds bestaan: lage resolutie en honderden genen om uit te splitsen. Als de SNP’s echter beperkt zijn tot een eindig aantal genen, is het misschien mogelijk om de genenlijst te beperken tot een aanzienlijk aantal kandidaten. Een recente studie met C57BL / 6J en de nauw verwante C57L / J- en C58 / J-stammen suggereert dat deze benadering nuttig zal zijn.10
Samenvattend moeten onderzoekers op hun hoede zijn voor de verschillen tussen B6-substrains als hun bijdrage om genetische benaderingen van complexe eigenschappen voorwaarts en om te keren, moet volledig worden gerealiseerd. Als onderzoekers bereid zijn om deze verschillen aan te pakken, kunnen ze hun mogelijke verstorende effecten minimaliseren en tegelijkertijd de kans op nieuwe genontdekking maximaliseren. Het is belangrijk om de genomen van andere substrains van B6 / J en B6 / N te sequencen, omdat er gedrags- en genetische verschillen bestaan, zelfs binnen stammen die zijn afgeleid van elk van deze twee kernsubstromen.1 Ten slotte is het belangrijk om te bedenken dat omgevingsverschillen ook kunnen bestaan. spelen een belangrijke rol bij de fenotypische variatie tussen B6-substrains en daarom kan deze vraag worden beantwoord door cross-bevorderende studies en andere benaderingen die proberen te controleren voor de substrain-omgeving.
